1.1 Nukleinsäuren, DNA = Desoxyribonukleinsäure Teil II

 

Basenpaarung

Die Nukleotide sind nun über die 3´-Position an der Pentose miteinander verbunden. Damit ergibt sich eine Kette von Phosphorsäure und 2-Desoxy-Ribose, aus der jeweils die Basen seitlich herausstehen mit 2 Enden, dem 5´Ende und 3´-Ende.

Die beiden Stränge sind gegenläufig. Adenin paart sich immer mit Thymin und Guanin mit Cytosin. Bei der A-T-Paarung findet man 2 Wasserstoffbrücken, bei der C-G-Paarung 3 H-Brücken. Die gepaarten Basen liegen in einer Ebene. DNA enthält also gleichviel Cytosin wie Guanin und gleichviel Adenin wie Thymin. Die Basensequenz ist aperiodisch.

Als Rückgrat des DNA-Stranges fungiert die abwechselnde Kette von Phosphat-Zucker-Phosphat-Zucker usw.

Diese Merkmale zeigen sich auch in der Sekundärstruktur der DNA. Das DNA-Molekül liegt räumlich als Helix vor. Da die beiden Stränge umeinandergewunden sind, bezeichnet man die Konformation der DNA als Doppelhelix. Die Eigenschaft der umeinander gewundenen Einzelstränge wird als plektonemisch bezeichnet. Die DNA-Helix ist rechtsgewunden.

In der Abb. 16 links ist die bisher besprochene Primärstruktur und die Sekundärstruktur zu sehen. Dabei bilden die gepaarten Basen die Sprossen der DNA-Leiter.

Sekundärstruktur und Stabilisierung

Links ist ein Ausschnitt eines DNA-Doppelstrangs von der Seite als Drahtmodell zusehen. Dabei fällt auf, daß die gepaarten Basen eine Ebene bilden, also gestapelt übereinander liegen. Dadurch entsteht ein sogenannter Stacking-Effekt, der wegen der gestapelten aromatischen Ringe der Doppelhelix eine höhere Festigkeit verleiht.

Weiterhin wird die Doppelhelix durch Wasserstoffbrücken zwischen den Windungen der Helices stabilisiert.

Die Basenpaarung im Drahtmodell links zeigt die Ebene der sich gegenüberliegenden Basen mit den beiden H-Brücken zwischen Adenin und Thymin, die zwischen den funktionellen Gruppen der Basen und den N-Atome sich ausbilden.

Die Basenpaare dienen auch als Maß für die Genomgröße, beim Mensch ca. 3 x109.

Denaturierung

Bei Temperaturen von 100 C° wird die DNA-Doppelhelix nach 3 bis 5 Minuten in ihre beiden Einzelstränge getrennt. Man spricht wie bei den Proteinen von Hitze-Denaturierung. Wendet man längere Zeit 65°C auf die Einzelstränge an, findet Renaturierung oder Hybridisierung statt (die beiden Stränge lagern sich wieder zum Doppelstrang zusammen).

DNA-Nachweis und Isolierung

Die Standardmethode DNA oder DNA-Bruchstücke zu trennen, zu identifizieren und zu reinigen ist die Gelelektrophorese mit Agarose-Gelen. Mit der Elektrophorese können Stoffe aufgrund ihrer Ladung (Größe) getrennt werden. Die Technik ist einfach, schnell durchzuführen und in der Lage komplexe Gemische aufzutrennen. Die Position der DNA im Gel kann direkt bestimmt werden. Dazu werden Banden der DNA mit dem Fluoreszenz-Farbstoff Ethidium-Bromid angefärbt. Auf diese Weise können kleinste Mengen im Bereich von 1ng DNA mit Hilfe von UV-Licht nachgewiesen werden. Der Farbstoff lagert sich zwischen die Basen und absorbiert bei 300 bzw. 360 nm UV-Licht oder übernimmt von der DNA absorbierte Energie von 260 nm und strahlt sie bei 590 nm im rot-orangen Bereich ab.

Die DNA ist bei neutralem pH negativ geladen (Phosphatgruppen), sie wandert deshalb zur Anode. Die Wanderungsrate der DNA im Agarosegel hängt von verschiedenen Faktoren wie der Größe der DNA-Moleküle, der Stärke des angelegten Stroms oder der Agarose-Konzentration ab.

Die DNA kann ebenfalls als Autoradiogramm nachgewiesen werden.

DNA-Fingerprint (genetischer Fingerabdruck)

Links ist das Autoradiogramm der DNA-Fingerprints aus einer Blutspur an einem Menschen zu sehen, der einem Verbrechen zum Opfer gefallen ist.

Vergleichen Sie das Bandenmuster der Blutspur mit den DNA-Proben der Verdächtigen!

Die DNA eines Individuums ist spezifisch wie ein Fingerabdruck. Dies wird heute in der Kriminaltechnik oder bei Vaterschaftsnachweisen angewandt.

Dazu werden Spuren der DNA aus Blut oder Samen gewonnen, mit Hilfe spezieller Enzyme (Restriktionsenzyme) in kleine Stücke geschnitten und durch Gelelektrophorese getrennt. Man erhält nach Anfärbung oder Markierung ein typisches Bandenmuster. Die Anzahl und Form der Banden wird als genetischer Fingerabdruck bezeichnet.

Die Technik wurde in den 80er Jahren entwickelt. Shockwave-Animationen zur DNA können Sie hier sehen: http://rna.micro.umass.edu/~molgent/

DNA als Träger der Erbinformation

1944 hat Oswald Avery durch den Transformationsversuch von Griffith (1928) nachgewiesen, daß DNA der Träger der Erbinformation ist. Dazu benutzte er Bakterien des Stamms Streptococcus pneumoniae und Labormäuse.

Von Pneumococcen gibt es Stämme, die eine Schleimkapsel besitzen und virulent sind, also Lungenentzündung hervorrufen (= S-STAMM). Daneben gibt es welche, die keine Schleimkapsel besitzen und auch nicht pathogen sind (= R-STAMM). Sie haben durch zufällige Mutation die Virulenz verloren.

Mit S-Stamm-Bakterien sterben die Mäuse an Lungenentzündung, bei Injektion der R-Stamm- Bakterien nicht.

Seit Griffith (1928) ist bekannt, daß wenn harmlose R-Stamm-Pneumokokken in Gegenwart von zellfreien Extrakten von S-Stamm Bakterien ( oder hitzegetötete S-Stamm) wachsen, die Eigenschaft der Virulenz auf die R-Stamm-Bakterien übertragen wird. Man findet nämlich virulente S-Stamm-Pneumokokken vor. Diesen Vorgang nannte Griffith Transformation. Transformation ist die Aufnahme von DNA aus der Umgebung. Der Sachverhalt ist nochmals unten dargestellt.

 

 

Abb. 15

DNA-Doppelstrang

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Abb. 16

DNA-Doppelhelix

 

 

 

 

 

 

 

Abb. 17

Ausschnitt der DNA im Drahtmodell

Klicken Sie auf das Bild zur 3-D Darstellung

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Abb. 18

Basenpaarung in der DNA

Biomoleküle siehe hier

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Abb. 19

DNA Hybridisierung

 

 

 

 

 

 

 

Abb. 20

Gelelektrophorese

 

 

 

Abb. 21

DNA-Fingerprint

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Abb. 22

Oswald Avery
(1877-1955)

 

 

 

Abb. 23

Transformationsversuch
von Griffith

 

 

Avery und Mitarbeiter testeten, welche Substanz die Transformation verursachte, indem Sie den zellfreien Extrakt fraktionierten und nach Molekülen trennten. Diese Fraktionen wurden dann auf Transformation getestet. Die DNA-Fraktion transformierte als einzige.

  1. Zunächst zentrifugierten Sie die Bakteriensuspension, in der sich R-Stamm und tote S-Stamm-Bakterien befanden, was größere Zellpartikel eliminierte. Die Bakterien transformierten aber immer noch.
  2. Nun gaben Sie Protease dazu. Dadurch wurden alle Proteine zerstört. Ergebnis: ebenfalls Transformation. Auch mit RNAse, Lipase und kohlenhydratspaltenden Enzymen zeigte sich kein Erfolg.
  3. Erst die Zugabe von DNAse unterband die Transformation. Sie folgerten daraus, daß DNA das transformierende Prinzip sei, also Träger der Erbinformation

Aufbau und Vorkommen der RNA

Neben der Nukleinsäure DNA als Träger der Erbinformation ist noch RNA (= Ribonukleinsäure) an den molekularen Prozessen um die Erbinformation beteiligt. Sie kommt in der Zelle in 3 Formen vor: 

5%

m-RNA = Messenger-RNA oder Boten-RNA

entsteht beim Kopieren der Gene

15%

t-RNA = transfer-RNA

transportiert Aminosäuren zu den Ribosomen

80%

r-RNA = ribosomale RNA

daraus bestehen Ribosomen

Die Nukleotide der RNA bestehen im Unterschied zu DNA aus der Pentose Ribose. Weiterhin ist nicht Thymin enthalten, sondern das Derivat Uracil.

Die 4 in RNA vorkommenden Basen sind also: Adenin (A), Guanin (G), Cytosin (C) und Uracil (U).

Zudem kommt RNA fast immer einsträngig vor, trotzdem gibt es Basenpaarung, da sich das Molekül räumlich faltet.

Nachfolgend ist ein t-RNA-Molekül dargestellt.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Abb. 24

Uracil als Nukelotidbaustein
der RNA

 

Klicken Sie auf das Bild um RNA in 3D zusehen

Abb. 25

t-RNA

 

Klicken Sie auf das Bild um die t-RNA Phe in 3D zusehen

 

t-RNA-Moleküle besitzen eine typische 3-D-Struktur mit 3 Schleifen, die für die Proteinbiosynthese an den Ribosomen wichtig sind. Das sogenannte Anticodon ist eine Abfolge von 3 Nukleotiden in der Anticodonschleife, die spezifisch für die einzelnen t-RNA-Moleküle ist. Es gibt mehr als 20 verschiedene t-RNA-Spezies in einer Zelle, jedes mit einem anderen Anticodon und auf der entgegengesetzten Molekülseite mit einer anderen Aminosäure. Alle t-RNA-Moleküle besitzen zwischen 75 und 90 Nukleotide. Darin kommen häufig auch sogenannte modifizierte Basen vor, z. B. Wybutosin, ein stark modifiziertes Guanosin oder Dihydrouracil, Thiouracil, Pseudouracil und 5-Methylcytidin.

Herstellung der RNA

m-RNA wird immer dann im Zellkern hergestellt, wenn die Information der Gene zur Herstellung von Enzymen benötigt werden.

Die rRNA wird im Zellkern innerhalb von speziellen Strukturen produziert: den Nukleoli. Im Zellkern können mehrere davon enthalten sein. Dies sind rundliche, stark färbbare Körperchen. In ihnen liegen bestimmte Chromosomen mit den Genen von ribosomaler RNA. Ein Zelle stellt hier pro Minute bis zu 10 000 Ribosomen her.

In Abb. 26 ist im ELMI-Bild der Ausschnitt eines Chromatinfadens im Nukleolus abgebildet, an dem gerade rRNA synthetisiert wird.

 

 

 

 

 

 

 

 

Abb. 26

Herstellung der r-RNA im Nukleolus

 

 

 

 

 

 

 

 

Abb. 26

Chromatinfaden im Nuleolus

 

 

Weiterführende Quellen:

Genetik- Onlinekurs

http://gslc.genetics.utah.edu
http://www.ornl.gov/hgmis/publicat/primer/intro.html

DNA im WEB http://www.umass.edu/microbio/chime/dna/fs_code.htm
http://www.ch.ic.ac.uk/motm/

Einführung in die DNA-Struktur
Animationen

http://vector.cshl.org/resources/BiologyAnimationLibrary.htm
http://web.jjay.cuny.edu/~acarpi/NSC/12-dna.htm

Isolierung der Chromosomen aus Speicheldrüsen

http://gslc.genetics.utah.edu

Isolierung von RNA

http://www.dartmouth.edu/artsci/bio/ambros/protocols/MGH_protocols/ koelle_prot/X0014_worm_RNA_prep.html

Isolierung der DNA aus Würmern

http://www.dartmouth.edu/artsci/bio/ambros/protocols/MGH_protocols/ Worm_genomic_DNA.html

Gelelektrophorese

http://littleshop.physics.colostate.edu/Everyday%20Science/Videos/LittleShop/
Gelelectrophoresis/gelelectroph.html

http://www.hhmi.princeton.edu/sw/2001/phughs/Hughes/Professional
Development/gelelectrophoresis.html

DNA-Fingerprint

http://www.fi.edu/qa98/biology/biopoint6.html
http://www.pbs.org/wgbh/nova/sheppard/analyze.html

RNA

http://www.iacr.bbsrc.ac.uk/notebook/courses/guide/rnast.htm

Nukleotide

http://www.med.unibs.it/~marchesi/nucleic.html

Nukleolus

http://cellbio.utmb.edu/cellbio/nucleus3.htm