DNA Fingerprinting

Mit dem genetischen Fingerabdruck oder der DNA-Fingerprintmethode können DNA-Spuren aus verschiedenen Quellen miteinander verglichen werden. Es gibt verschiedene Methoden darunter ist die Methode basierend auf VNTR- Polymorphismus (Polymorphismus = multiple Allelie) weit verbreitet. Ein Allel ist eine bestimmte Genvariante. Der Mensch kann von bestimmten Genen unterschiedliche Varianten besitzen, z.B. gibt es verschiedene Allele der Gene für die Haarfarbe. Zwischen den Genen sind in den Chromosomen nichtcodierende Abschnitte enthalten, innerhalb Genen eingestreut nennt man diese INTRONS.

Sie enthalten neben abgeschalteten Pseudogenen, die ihre Funktion verloren haben und als "evolutionärer Ballast" erhalten geblieben sind, überwiegend DNA-Abschnitte, die sich aus Blöcken sich wiederholender "repetitiver" Sequenzen zusammensetzen. Diese werden je nach Länge der Repetitivsequenz als Minisatelliten (Multi- und Einzellokus-Systeme, typische Repeatlänge 15-50 Basen) oder VNTRs (=Variable-number-of-tandem-repeats) genannt. Daneben gibt es auch Mikrosatelliten (Länge 2-5 Basen), die man als STR-Systeme (STR = Short Tandem Repeats), bezeichnet. Während bei Minisatelliten über 100 Repeats hintereinander liegen können, so findet man bei STR's typischerweise zwischen 8 und 25 Wiederholungen.

Darin unterscheiden sich alle Individuen.

Bei der DNA-Identifizierung durch das FBI wird die Polymerase chain reaction (PCR) Verstärkung von 4 Basen langen STR Sequenzen verwendet. Das FBI hat seine Methode CODIS genannt für "Combined DNA Index System". Das CODIS System der Personenidentifikation nutzt 13 STR Loci im menschlichen Genom.

Neben der Identität von Personen kann man durch die DNA-Fingerprintanalyse auch über deren Abstammung Informationen erhalten. Im einfachsten Fall handelt es sich um den Nachweis der direkten Elternschaft, in Form eines Vaterschaftstests. Bei Nicht-Übereinstimmung bestimmter genetischer Muster kann eine Eltern-Kind-Verwandtschaft mit Sicherheit ausgeschlossen werden. Prominentes Beispiel,das öffentliches Aufsehen erregte, war die Widerlegung der Behauptung von Anne Anderson, die verschollene Zarentochter Anastasia zu sein, ebenso wie der Fall Kaspar Hauser, dessen Herkunft aus dem Haus Baden anhand von Blutspuren auf seiner Kleidung ausgeschlossen werden konnte.

Genealogen (Stammbaumforscher) können mit Hilfe von mtDNA (= mitochondrialer DNA) die mütterlichen Linien verfolgen und mit dem Y-Chromosom die väterliche Linie. Genetische Unterschiede zwischen menschlichen Populationen sind normalerweise für das Y Chromosom größer als für die mtDNA.

Dabei werden wieder bestimmte genetische Marker auf der entsprechenden DNA verwendet. So kann man von Großeltern bis 10 000 Jahre zurück schließen.

Mitochondrien werden nur durch die Eizelle ( mütterliche Linie) weitergegeben. Die Mitochondrien der Spermatozoen sind zur Zerstörung markiert und werden nach der Befruchtung zur Zygote bis zum 4-Zellstadium abgebaut.

Die Eizelle in Säugetieren enthält ca. 100,000 mtDNA-Moleküle, eine Spermienzelle ca. 100–1500 mtDNAs. Da Mitochondrien kein DNA-Reparatursystem enthalten, gibt es eine viel höhere Mutationsrate (ca. 10^-7 Mutationen pro bp pro Generation) als im Kern-Genom ( ca. 2 x 10^-8 pro bp pro Generation). Jede Zelle enthält hunderte Mitochondrien mit ca. 2 -10 mtDNA-Kopien. Normalerweise sind alle mtDNAs in einer Zelle identisch (= Homoplasmie).
Die ungefähre Anzahl an Unterschieden in Basenpaaren zwischen 2 menschlichen mtDNAs werden auf 9.5 bis 66 geschätzt (Zeviani et al. 1998). Die hohe Mutationsrate führte zu einer großen Anzahl populationsspezifischer Basensubstitutionen.

Das "Human Genome Project", ein weltweites Forscher-Konsortium veröffentlichte seit 1981 die komplette Sequenz der menschlichen mitochondrialen DNA (mtDNA). Diese wurde als "Cambridge reference sequence" (CRS) bekannt und 1999 resequenziert und Fehler beseitigt. Inzwischen hat man mehrere hundert (560) verschiedene mitochondriale Genome verschiedener menschlicher Populationen sequenziert und fand verschiedene Mutationen und Polymorphismen. Derzeit ist man dabei herauszufinden, welche Veränderungen zu welchen Krankheiten führen. Als erster Schritt wird jede neue Sequenz mit den anderen und der CRS verglichen.

Verglichen mit dem menschlichen Genom mit seinen 3 Milliarden DNA-Bausteinen ist das mitochondriale Genom mit seinen 16500 Basenpaaren winzig. Jede der 560 Sequenzen wurde klassifiziert und anhand der Muster der Polymorphismen (Haplotypen) die prähistorische Wanderung der Menschen rekonstruiert.

Dabei ist wichtig, daß die mitochondriale DNA keiner Rekombination wie z.B. bei der Meiose unterliegt ( also Austausch von Chromosomenstücken der beiden homologen Chromosomen). Es gibt auch keine Introns wie bei der eukaryontischen DNA nur im sog. D-Loop (=displacement-Loop) 2 nichtcodierende Sequenzen, einer Region von 1121 bp, die den Replikationsursprung und die Promotoren für die Transkription enthalten.

Es gibt 2 Bereiche der mtDNA, die für die Wissenschaftler besonders interessant sind, da sich hier die Variabilität innerhalb der menschlichen Population zeigt. Diese werden HVR1 und HVR2 (=hypervariable segments) bezeichnet.

Die grundsätzlichen Haplogruppen werden mit Großbuchstaben bezeichnet. Ca. 76% aller afrikanischen mtDNAs fällt in den Haplotyp L, 77% der asiatischen mtDNAs fallen in die Gruppen A, B, C, D, E, F, G, M, P, Q und Z. In Amerika findet man die Haplogruppen A, B, C, D, und X, die Haplotypen H, I , J, K, T, N, U, V, W und X in West-Eurasien. In Australien und Ozeaneien gibt es nur die Haplotypen M und N.

Mit einer Mutationsrate von 1 in 10 000 Jahren konnte festgestellt werden, daß jeder in Europa von nur 7 Frauen abstammt. Diese kamen während der letzten 45,000 Jahre zu verschiedener Zeit nach Europa und überlebten. Man nannte sie die 7 Töchter der Eva: Ursula, Xenia, Tara, Helena, Katrine, Valda and Jasmine nach Prof. Sykes Uni Oxford.

Die Analyse der mtDNA aus verschiedenen Neanderthalknochen ergab keine Rekombination zwischen dem modernen Menschen und Neanderthalern. Sie lebten tausende von Jahren parallel.

Durchführung des genetischen Fingerabdrucks

Weitere gentechnische Methoden

• Hybridisierung isolierter Einstrang-DNA mit radioaktiven Proben
• Gentherapie

Gentechnisch hergestellte Medikamente

Erythropoietin (EPO), ist ein Glycoprotein-Hormon (165 As), das hauptsächlich in der Niere (aber auch den Hepatozyten der Leber) von Blutgefäßzellen des peritubulären Kapillarnetz und für die Regulation der roten Blutkörperchen (Erythrozyten) verantwortlich ist. Die EPO-Produktion wird durch den O2-Gehalt in den Nierenarterien stimuliert.

Auf diese Weise wird die Zahl der Erythrozyten wieder aufgefüllt. Die Primärwirkung von EPO funktioniert nach dem Andocken an 2 Membranrezeptoren (EpoR) der Stammzellen im Knochenmark über eine MAP-Kinase-Kaskade, Phosphorylierung des Stat5-Transkriptionsaktivators, Dimerisierung und Genaktivierung von Zielgenen, die die Reifung zu Erythrozyten bewirken.

Die Stärke der EPO-Wirkung hängt von der Größe der Anämie (Blutarmut) oder Hypoxie (Sauerstoffunterversorgung) ab. Normalerweise wird bei einer Hämoglobin-Konzentration von mehr als ~12 g/dl (7.5 mmol/l) kein EPO ausgeschüttet. Fällt die Hb-Konzentration unter 12 g/dl (7.5 mmol/l), steigt die EPO-Ausschüttung stark an.

Um die Bildung der Erythrozyten anzuregen und damit der Anämie entgegenzuwirken, wird heute neben der Gabe von Eisen zur Hämoglobin-Synthese mit Erfolg rekombinantes Erythropoietin (rhEPO) eingesetzt. Es entspricht im Aufbau und in der Zusammensetzung dem natürlichen EPO. Rh-EPO wurde wird durch rekombinante DNA-Technologie aus einer Phagen-Bibliothek isoliert in Ovarzellen des Chinesischen Hamsters (CHO) mit einer Reinheit von > 98% hergestellt. (Test durch RP-HPLC=Hochleistungsflüssigkeits-Chromatographie )

Das Gen, das für das menschliche EPO codiert wurde 1985 geklont und für die gentechnische Herstellung von rekombinanten, menschlichen EPO (rhu-EPO) verwendet. Rh-EPO wurde inzwischen bei vielen verschiedenen Krankheitssituationen wie z.B. der Anämie bei Nierenversagen oder bei HIV-Patienten , die mit AZT behandelt worden sind bzw. bei der Anämie im Falle einer Krebs-Chemotherapie.

Relativ bekannt in der Öffentlichkeit wurde es durch Dopingfälle beim Radsport. Das Internationale Olympische Komitee (IOC) verbietet seit ca. 12 Jahren den Gebrauch von EPO. Der direkte Nachweis von rhEPO basiert auf der isoelektrischen Fokussierung (IEF) von Urinkonzentraten. Grundlage des Tests ist die Unterscheidung von humanem EPO (hEPO), das der menschliche Organismus selber synthetisiert und von rekombinantem EPO (rhEPO), das gentechnisch hergestellt wird und als körperfremdes EPO zu betrachten ist.

Gentherapie bei Mukoviszidose

Cystische Fibrose (CF = Mukoviszidose) ist eine der schlimmsten Erbkrankheiten, die durch die Vererbung eines defekten, rezessiven autosomalen Gens auf Chromosom 7 entsteht. Die ungefähre Lebenserwartung der ca. 8000 Patienten in Deutschland beträgt weniger als 30 Jahre. Das für die Cystische Fibrose verantwortliche Gen codiert für das CFTR -Protein (= transmembrane conductance regulator). CFTR ist ein durch cAMP geregelter Cl- Ionenkanal in den apikalen Membranen von sekretorischen Zellen. (Lunge, Bauchspeicheldrüse usw.)

Mutationen im CTFR-Protein unterbrechen den epithelialen Ionentransport im Lungen- und Bauchspeicheldrüsengewebe und können zu Atemversagen, Pankreas Insuffizienz und anderen Defekten führen. Neben der konventionellen Therapie zur Linderung der Symptome wird seit der Entdeckung der genetischen Ursache und des Gendefekts der CF 1989 bis heute intensiv an einer Gentherapie geforscht.

Da die CTFR-Ionenkanäle in verschiedenen Epithel- und Drüsenzellen ausgebildet werden ist es schwierig, mit der derzeitigen Technik durch Gentherapie die natürliche Wirkung der CF-verursachenden Gene wiederherzustellen.

Ca. 70% der CF-Patienten weisen eine bestimmte Mutation im CTFR auf. Hier fehlt die Aminosäure Phenylalanin in Position 508 des Proteins, weshalb die Mutation den Namen Delta-F-508 erhielt. Dies führt zu einem räumlich deformierten CFTR-Protein ohne Tunnelfunktion. Inzwischen sind über weitere 700 Genveränderungen bekannt, die mit dem Krankheitsbild der Mukoviszidose einhergehen.

Als möglicher Vektor für die Gentherapie steht das Adenovirus mit seiner Fähigkeit, spezifisch Atemwegsepithelien zu infizieren, zur Debatte. Das Virus wird durch das Entfernen einer bestimmten Region seiner DNA replikationsunfähig gemacht. An dieser Stelle wird eine Expressionskassette eingebaut, in der ein Promotor die eingesetzte CFTR-DNA antreibt. Das Virus bindet zunächst an spezifische Rezeptoren der Epithelzellen, die sog. Coated pits, über die es per Endocytose in die Zelle gelangt. Dort wird es als fremd erkannt und zum Endosom verpackt. Dadurch gelangt es in den Zellkern hinein und verliert dort seine Proteinhülle. So konnte sowohl in vitro als auch in vivo an Ratten die fehlende CFTR-DNA in Bronchialepithelien übertragen werden. Die virale DNA mit dem CFTR-Promotor liegt im Zellkern neben den Chromosomen und wird dort exprimiert. In klinischen Studien an CF-Patienten stellte sich der Erfolg leider noch nicht ein, bei Mäusen gelang gelang es jedoch.