Gelelektrophorese

Elektrophorese ist eine Technik um meist Makromoleküle zu trennen oder zu reinigen. Heute ist sie in der Biochemie und Molekularbiologie für die Trennung von Proteinen und Nukleinsäuren, die sich in Ladung, Größe und Konformation unterscheiden unabdingbar.

Setzt man geladen Moleküle einem elektrischen Feld aus wandern Sie entsprechend ihrer Ladung zum positiven (+ = Anode) oder negativen (- = Kathode) Pol. Die Geschwindigkeit ist direkt proportional zur verwendeten Ladungsstärke. Im Gegensatz zu Proteinen, die je nach basischen oder sauren Resten entweder eine netto-positive Ladung oder netto-negative Ladung haben können besizuen Nukleinsäuren durch ihren Phosphat-Backbone eine durchgängig negative Ladung und wandern zur Anode. Nachfolgend einige Zusammenhänge, die für die Gelelektrophorese gelten:

Bei der elektrophoretischen Trennung von Nukleinsäuren gilt, daß die Mobilität unabhängig von der Größe ist. Das Gel siebt die Moleküle, große Moleküle bewegen sich langsamer, da sie schlechter durch die Poren gelangen.

Man verwendet Agarose- (große Poren) oder Polyacrylamidgele (große Bandbreite von Porenweiten). Dabei werden Agarosegele für Nukleinsäuren bis zu M = 150 x 10⁶ 0,2% und 0.8 % für Nukleinsäuren bis zu M = 50 x 10⁶ verwendet. Polyacrylamidgele werden für kleinere Nukleinsäuren genommen.

Bei der SDS Acrylamid Gelelekrophorese wird ein SDS (Sodium-Dodecylsulfat = Detergenz) als Puffer verwendet, der die Proteine denaturiert und sich an sie bindet, sodaß diese je nach Größe ein gleiches Ladungs/Massenverhltnis ausbilden.

Dadurch können Sie entsprechend Ihres MW getrennt werden.

Nach erfolgter Trennung wird das Gel mit einem entsprechenden Farbstoff angefärbt um die in Banden getrennten unterschiedlich großen Moleküle sichtbar zu machen. Für DNA wird z.B. Ethidiumbromid verwendet und dann unter UV-Licht analysiert-oder mit einem DNA-Färbemittel wie Azur B-Chlorid.

Verdächtiger 1 ist mit Sperma identisch und die Zellen der Frau mit dem Opfer.

Der Ablauf einer Gelelektrophorese am Beispiel eines DNA Fingerprint kann hier genau verfolgt werden. Siehe auch die Quellen unten für weitere und genau Anleitungen.

Gentechnik bei Pflanzen

Pflanzen lassen sich relativ leicht klonen, da sie die natürliche Fähigkeit der Regeneration aus fast allen Geweben besitzen. Dagegen sind die Gentechniker auf relativ wenige Vektoren angewiesen im Unterschied zu Tierzellen, wo man auf einen große Palette von Plasmiden zurückgreifen kann.

Deshalb erfanden die Wissenschaftler andere Methoden, um Gene in Pflanzenzellen zu befördern. Dazu gehören die Mikroinjektion, die Elektroporation und das Partikel Bombardement mit Genpistolen.

Bei der Mikroinjektion wird die DNA mit einer Mikropipette injiziert. Dies wird or allem bei der künstlichen Befruchtung angewandt.

Die Anwendung weniger Piezoimpulse kann den Durchtritt durch die Membran erleichtern.

Um Transgene Organismen zu erzeugen werden auch fremde Gene microinjiziert. Gene aus fremden Organismen können jedoch nicht unmodifiziert injiziert werden sondern müssen eine bestimmte Struktur besitzen um korrekt in der fremden Zelle zu arbeiten.

Viele Gene arbeiten nur in bestimmten Geweben eines Organismus. Deshalb muß das Transgen zusätzlich einen speziellen Promotor enthalten. Weiterhin muß nach dem Strukturgen zur Terminierung eine PolyA-Sequenz intergriert sein, um die Transkription zu beenden.

Bei der Elektroporation werden kurze und hohe Spannungsimpulse benutzt, um Membranporen zu erzeugen und so die DNA in die Zelle zu befördern. Abb. 148 zeigt eine Elektroporationsgerät. Das Schaltdiagramm zeigt die einfache Arbeitsweise.
Eine Zellsuspension wie z.B. pflanzliche Protoplasten wird in einer speziellen Küvette eingefüllt. Dazu wird eine Lösung mit DNA- Fragmenten, die die zu transformierenden Gene enthält gegeben. Der Kondensator wird geladen, wenn der rechte Schalter geschlossen wird. Die Elektroporation durch Gleichspannung (200- 2500V) der Membran in der Suspension erfolgt durch Entladung mit Schließen des linken Schalters.

Beim Partikel Bombardement werden winzige DNA-beschichtete Goldpartikel durch die Pflanzenzellwände gebracht. (siehe Abb. 149 )

Weltweit forschen unterschiedlichste Institutionen, von Universitäten bis zu industriellen Labors. Dabei sind Mutanten der Blüte, die von wenigen Genen kontrolliert wird wie die hormonelle Signalübertragung und Auswirkung auf die Samenentwicklung und Fruchtreifung interessant. Weiterhin hat z.B. die Arabidopsisforschung Hinweise auf lichtgesteuerte biologische Uhren in Pflanzen gegeben und Zusammenhänge mit Krankheiten beim Menschen aufgedeckt.

Arabidopsis thaliana (= Ackerschmalwand) ist eine kleine Blütenpflanze auf den Feldern und Wiesen, die seit 1943 als botanischer Modellorganismus verwendet wird. Arabidopsis gehört zur Familie der Kreuzblütler (Brassicaceae) mit meist einjährigen Arten. Seit Jahrhunderten wurden Kohl und Rettich aus dieser Pflanzenfamilie kultiviert. Arabidopsis ist enorm wichtig für die Grundlagenforschung in der Molekularbiologie und Genetik.

Das relativ kleine Genom (114.5 Mb/125 Mb total) mit Chromosomen von Arabidopsis wurde 2000 als erstes Pflanzengenom vollständig entschlüsselt. Davon liegen inzwischen umfangreiche Genkarten vor. Außerdem hat Arabidopsis ein kurze Generationszeit ( ca. 6 Wochen) von der Keimung bis zur Samenreife und die Anzucht gelingt mit wenig Aufwand mit geringem Raumbedarf. Die Transformation gelingt leicht mit Agrobacterium tumefaciens und es liegt ein große Vielfalt genetischer Mutanten vor.

Das Genom von Arabidopsis umfaßt in den 5 Chromosomen ca. 26 000 Gene, in den Chloroplasten ca. 80 und in den Mitochondrien ca. 60 Gene.

Agrobacterium tumefaciens ist ein verbreitetes, gramnegatives, phytopathogenes Bodenbakterium, das für die Wurzelhalsgalle bei vielen höheren dikotylen Pflanzen verantwortlich ist. Diese Krankheit verursacht weltweit beträchliche landwirtschaftliche Schäden. Ende 2001 wurde die komplette Genomsequenz von Agrobacterium tumefaciens C58 veröffentlicht. Es ist 5,67 Millionen Basenpaare groß und besteht aus einem großen ringförmig geschlossenem DNA-Molekül und zwei kleineren Plasmiden. Man fand 5.400 Gene.

Wurzelhalsgallen werden mit zunehmender Größe fleckig- dunkelbraun und können einen Durchmesser von 30 cm erreichen. Im Herbst verfaulen die Tumore, treten im darauffolgenden Frühling aber wieder hervor. Infizierte Pflanzen sind in ihrer Entwicklung gehemmt, produzieren kleinere Blätter und sind empfindlicher gegenüber Umwelteinflüssen. Deshalb kommt es beim Befall von Nutzpflanzen zu Ertragsminderung. Sie ist das Ergebnis der Expression von Genen bakteriellen Ursprungs, die stabil ins pflanzliche Genom integriert werden. Die bakteriellen Gene veranlassen die Pflanzenzelle zur Überproduktion der Phytohormone Auxin und Cytokinin sowie der nicht-pflanzlichen Aminosäuren der Opine. Dies führt zu unkontrolliertem Zellwachstum (= Tumor).

A.tumefaciens enthält das ca. 220000 bp große Ti- Plasmid. (Ti= Tumor induzierend) Dieses trägt neben dem Replikationsursprung die Virulenzgene, die T-DNA und Gene für den Opinkatabolismus. Die gesamte T-DNA liegt zwischen zwei sie rechts und links begrenzende, 25bp großen Sequenzwiederholungen (linke und rechte DNA-Grenze). Die T-DNA trägt Gene für die Synthese der Pflanzenhormone Auxin und Cytokin sowie Gene für Opine und wird als einzelsträngige DNA in das Pflanzenzellgenom integriert. Opine sind seltene Aminosäurederivate des Arginins zu denen z.B Octopin und Nopalin gehören und dienen A.tumefaciens als Kohlenstoff- und Stickstoffquelle, können jedoch nicht von der Wirtszelle weiterverarbeitet werden. Die Virulenzgene sind für den Transfer der T-DNA in die Pflanzenzelle essentiell.

Infektion durch Agrobakterium

Die Infektion beginnt bei einer Pflanze mit einer verwundeten Stelle, z.B. oft im unteren Stammbereich (Verletzung durch Ackergeräte). Die verletzten Gewebe produzieren phenolische Lockstoffe, was das Bakterium chemotaktisch anlockt und die Konjugation (seitliche Aneinanderlagerung) der beiden Zellen verursacht. Die Lockstoffe aktivieren eine Transmembran-Proteinkinase (VirA) des Bakteriums, die seinerseits virG durch Phosphorylierung aktiviert. VirG dockt an regulatorische Bereiche des Ti-Plasmids an und steuert die Expression weiterer Vir- Gene.

VirD2 schneidet als Endonuklease an der linken und rechten DNA-Grenze ein Stück der Ti-Plasmid-DNA aus (Einzelstrang). VirE2 bindet sich an den gebildeten Einzelstrang und schützt ihn so vor dem Abbau durch Nucleasen und geleitet die T-DNA zur bakteriellen Membran. Über einen von VirB –Proteinen gebildeten Porenkomplex gelangt die T-DNA in die Pflanzenzelle und wird unspezifisch ins Pflanzenzellgenom integriert.

Diesen einzig bekannten Mechanismus der Transformation eines Plasmids in ein eukaryontisches Genom macht man sich heute in der Gentechnik zu Nutzen.

Der Gentransfer mit Hilfe des Ti Plasmids erfordert mehrere Schritte:

• Die Tumorgene der T- DNA müssen inaktiviert werden
• Implantation eines selektiven Markers um die transformierten Zellen zu erkennen, z.B. das Neomycin Phosphotransferase II (NPT II) Gen aus Bakterien. Dadurch können die Zellen in Gegenwart des Antibiotikums Kanamycin wachsen und so selektiert werden.
  
• Um diese bakterielle Sequenz zu regulieren benötigte man eukaryontische Promotoren wie den CaMV 35S Promotor aus dem Blumenkohl Mosaic Virus, der eine hohe Effizienz bei der Genexpression hat.
• Fremdgene müssen an dieselbe Stelle des Ti-Plasmids integriert werden. Heute gibt es verschiedene synthetische T-DNA-Plasmide.
• Das rekombinante Plasmid mit dem integrierten Gen muß dann wieder in die A. tumefaciens Zelle transferiert werden. Die Bakterienzelle muß nun in das Protoplasma der Pflanzenzelle gebracht werden.

Natürlicherweise infiziert A. tumefaciens nur Dikotyle, also ca. 170,000 verschiedene Arten wie Rosen, Äpfel, Sojabohnen, Kartoffeln, Birnen und Tabak. Für monokotyle Kulturpflanzen wie Mais, Reis, Weizen, usw. benutzt man Partikelbombardement oder Elektroporation, um das synthetische Plasmid in die Zellen zu bekommen (siehe weiter unten).

Von Arabidopsis wurden inzwischen viele transgene Pflanzen erzeugt. Per Transformation mit Agrobacterium wurde ein Gen zur GFP-Produktion implementiert, das durch das Wachstumshormon Auxin kontrolliert wird und somit die Verteilung und lokale Wirkung des Hormons beim Wurzelwachstum in der Wurzelspitze anzeigt.

Abb. 148

Electroporator

Abb. 149

Gengun

BioRad

Abb. 152

Ti-Plasmid