1.6 Gentechnologie I
Plasmidtransfer, Restriktionsenzyme, DNA-Hybridisierung

In den letzten 30 Jahren haben die Wissenschaftler entdeckt, daß DNA (Gene) zwischen den Organismen austauschbar sind, egal ob Bakterium, Pilz, Pflanze oder Tier.

Bisher hat der Mensch durch Züchtung und Auswahl Tiere oder Pflanzen mit gewünschten Eigenschaften versehen, nun kann er mit Hilfe der Erkenntnisse der Molekularbiologie durch gezielten Gentransfer die Organismen mit Merkmalen ausstatten. Man nennt ein Lebenwesen, das DNA gentechnisch von einer anderen Quelle erhalten hat transgen.

Definition Biotechnologie:
Einsatz biologischer Systeme im Rahmen technischer Prozesse und industrieller Produktionen.

Definition Gentechnologie:
Anwendung moderner molekularbiologischer Methoden zur Änderung der genetischen Eigenschaften von Organismen. Man sagt dazu auch"rekombinante DNA-Technologie", weil damit Erbinformation gezielt re- bzw. neukombiniert werden kann.

Geschichte der Gentechnologie

Die Geschichte der Gentechnologie reicht 8000 und mehr Jahre zurück, als die Ureinwohner Amerikas eine heimische Pflanze namens Teosinte domestizierten. Genetische Studien belegen dies (nach Prof. Doebley und W. Galinat). C. Columbus war der erste Europäer, der des Ergebnis indianischer Gentechnik zu sehen bekam.

Sie benutzten schon damals die Technik des "Genetic Engineering", um ertragreichere Spezies zu züchten. Von der Teosinte (Abb. 128 ) mit kleinen Körnern existieren 2 Mutanten mit großen Körnern. Die Ureinwohner kreuzten die beiden Mutanten und erhielten den Fruchtstand des Mais mit noch größeren festsitzenden Körnern.

Der Grund für die Kreuzung ist in Abb. 128 oben zu sehen. Durch die Kreuzung erhielt man eine Rekombinante mit der vierfachen Samenanzahl wie die Teosinte. Die Rekombinante enthält auf Chromosom 2 eine Genverdopplung (Duplikation). Doch mit der Ertragssteigerung nicht genug.

Wie auch heute können natürliche Feinde die ganze Arbeit an einer Monokultur zunichte machen. Betrachtet man ein Getreidefeld aus der Sicht der Ökologie, so ist das Anlegen einer Monokultur ein Eingriff in die Nahrungskette. Die von der Getreidepflanze abhängigen anderen Arten wie Pilze und Insekten nehmen aufgrund des Überangebotes an Nahrung oder Lebensraum drastisch zu und vermindern damit aber den Ertrag. In Abb. 129 sind Getreideblätter (a,b) zusehen, die mit dem Pilz Helminthosporium maydis befallen sind. Dadurch können ganze Ernten vernichtet werden.

Es gibt allerdings auch Pflanzen, die gegen den Pilzbefall resistent sind (c). Sie bilden ein Gift, das den Befall verhindert. Schon die amerikanischen Ureinwohner isolierten diese resistenten Pflanzen und züchteten sie weiter. Weiterhin hat man resistente Varietäten mit Pilz-empfindlichen Arten gekreuzt, um resistente, ertragreiche Arten zu erhalten. Das so heute erhaltene Produkt, der Mais ist also die Arbeit von über 8000 Jahre Züchtung und Auslese.

Aufgrund unsere heutigen genetischen Kenntnisse wissen wir, daß der Mais durch Duplikation und mutierte Gene entstanden ist und außerdem das Genom durch Kreuzung mit zusätzlichen Resistenzgenen vergrößert worden ist. Die neuen Eigenschaften des Organismus sind also durch Ändern und Hinzufügen von DNA (Genen) erreicht worden. Dies hat ca. 8000 Jahre gedauert.

Man suchte nun eine Möglichkeit, die Integration von DNA mit gewünschten Eigenschaften schneller und einfacher zu erreichen.

Bei der Suche nach geeigneten Methoden erinnerte man sich an die Eigenschaften der Plasmide, kleinen DNA-Ringen in Bakterien mit spezifischen Genen für Antibiotika-Resistenz und -Produktion und anderen Eigenschaften. Auf Plasmide war man bei der Erforschung der Ursachen der Resistenz von Bakterien gestoßen. Plasmide replizieren sich unabhängig von der Haupt-DNA durch eine bestimmte Nukleotidsequenz, die in Nachbarschaft z.B. der Resistenzgene liegt.

Solche selbständigen DNA-Einheiten wie die Plasmide sind also die richtige Transporteinheit für Gene in Zellen.

Oben ist das E.Coli-Plasmid pBR322 abgebildet. pBR322 DNA wird aus E.coli (dam+, dcm+) isoliert und per Ultrazentrifugation durch einen Cäsiumchlorid-Gradienten in Gegenwart von Ethidiumbromid gereinigt. Das Molekül ist doppelsträngig, ringförmig und hat 4361 Basenpaare. Die eingezeichneten Stellen sind alles Nukleotidpositionen, wo bestimmte Restriktionsenzyme (siehe unten) spalten. Das Plasmid enthält 2 Resistenzgene (Markergene) gegen Ampicillin und Tetrazyklin.

Bei der Erforschung der Viren (zwischen 1950 und 1960) hatte man gelernt, daß bei der Infektion und Lyse einer Zelle hunderte von genetisch identischen Exemplaren entstehen, alle Klone des einen infizierenden Partikels.

Eine Eigenschaft von Bakterien, die man zuerst bei E.Coli entdeckt hatte, war eine weiterer Baustein für den künstlichen Transfer von DNA in Zellen. In Stanley Cohens Labor fand man heraus, daß CaCl2 die bakterielle Zellwand und Membran durchlässig machte, sodaß DNA aufgenommen werden konnte. Auf diese Weise schaffte man es, Plasmid-DNA mit Resistenzgenen in ein nicht resistentes Bakterium einzuschleusen.

Da sich die Bakterien mit dem aufgenommenen DNA-Stück identisch replizierten, konnte man so Millionen Kopien des Resistenzplasmids erzeugen. Dies war seit 1971 ein wichtiger Schritt auf dem Weg des "Genetic Engineering". Heute benutzt man neben der Transformation noch die Elektroporation oder Mikroprojektile (siehe unten), um DNA in die Zellen zu befördern.

Um das Prinzip der DNA-Aufnahme in Zellen genauer zu verstehen, untersuchte man die Plasmide weiter. Vielleicht konnten neben den Resistenzgenen noch andere eingeschleust werden. Dazu war eine Methode nötig, DNA-Stücke (Gene) zu verbinden. Man kannte die DNA-Ligase, die bei der Replikation DNA-Sequenzen verbinden konnte.
Ein weiterer Meilenstein in diesem Zusammenhang war die Entdeckung der Restriktions-Endonukleasen wie z.B EcoR1 durch Herbert W. Boyer 1972. Diese Enzyme konnten bestimmte Sequenzen erkennen (GAATTC) und (CTTAAC) und dort die DNA auf spezielle Art durchschneiden. In Bakterien dienen sie als Schutz gegen Viren. Da die eigene DNA methyliert ist, ist das Enzym wirkungslos.

Die Wirkung dieser Enzyme wird in Abb. 131 an EcoR1 gezeigt. Restriktionsenzyme umgeben die DNA an der Erkennungsstelle. (hier GAATTC) Meist liegt dort die komplementäre Sequenz als Palindrom vor, ist also umgekehrt ( CTTAAG) wie die codierende Sepquenz.

Ein Strang der DNA wird an einer Stelle und der andere an einer anderen Stelle, zwischen G und A durchgeschnitten. Die getrennten Stücke haben einen kurzen einsträngigen Abschnitt genannt "klebrige Enden".

DNA-Methylierung

DNA-Methylierung ist eine von verschiedenen Modifikationen nach der Replikation zum Schutz und der Regulation. Dabei hängt ein Enzym, die DNA-Methyltransferase, eine Methylgruppe (-CH3) an das Cytosin (C). Dies geschieht im Promotor vor dem Gen. (Nach der semikonservativen Replikation ist ein Strang schon methyliert.) Die methylierten Abschnitte nennt man CpG-Inseln, da in ihnen die DNA-Bausteinfolge CpG besonders häufig vorkommt. Vor jedem aktiven Gen sind diese Abschnitte nicht methyliert. Vor allem bei Krebs ist der Grad der DNA-Methylierung verändert. Es gibt eine Datenbank zur DNA-Methylierung (www.methdb.de). Eine gezielte Demethylierung, also das Entfernen der CH3-Gruppe, reaktiviert stummgeschaltete Gene.

 

Zurück zu den Restriktionsendonukleasen:

Ein anderes DNA-Stück mit ebenfalls einem klebrigen Ende kann sich mit dem komplementären Ende verbinden. Die neu gepaarten DNA-Stücke werden durch Ligase verbunden. Bei einem Plasmid sieht das so aus:

Man nennt die Aufnahme von genetischem Material durch eine Zelle Transformation. Somit sind Bakterien, die ein modifiziertes Plasmid erhalten transformierte Bakterien. In Abb. 136 sind leuchtende E.Coli zusehen, denen man ein Plasmid mit dem Quallengen für das grün fluoreszierende Protein GFP implantiert hat. Man nennt Organismen mit artfremden Genen transgen.
Im synthetischen Plasmid pGLO von BIORAD ( Abb. 136) ist das GFP-Gen und u.a. das Amp-Gen als Resistenzgen und das araC-Regulatorgen implementiert.

Heute gibt es viele Plasmide zum molekularen Klonen, die aus rekombinierten Fragmenten verschiedener natürlicher Plasmide künstlich hergestellt wurden. Sie enthalten zahlreiche Stellen ebenfalls für verschiedene Restriktionsenzyme.

Das synthetische Plasmid pUC19 enthält unter anderem im b-Galactosidase-Gen einen Geneinschub, um Gene mit bestimmter Länge zu transportieren.
Aus diesem Grund spricht man auch bei Plasmiden von
Vektoren. Das b-Galactosidase-Gen ist durch den künstlichen Geneinschub inaktiviert.

Neben den Plasmiden setzt man heute noch andere Vektoren ein:

  • Bakteriophagen
  • Cosmide
  • künstliche Chromosomen bei Hefe (YACs)
  • künstliche Chromosomen bei Bakterien (BACs)
Vector
Einbaugröße (kb)
 Plasmid
 <10 kb
Bacteriophage
9-20 kb
Cosmids
33-47 kb
BACs
75-125 kb
YACS
100-1000 kb

Die Einbaugrößen der DNA-Fragmente in kb=Kilobasen sind oben angegeben. Man nennt das Durchschneiden der DNA mit Restriktions-Enzymen und das Aufspüren durch radioaktive Proben per Gelelektrophorese und Autoradiogramm Southern Blot.

Cosmide sind Plasmid-Vectoren die cos-Sequenzen enthalten. Diese sind für die Integration in Phagen notwendig. z.B l-Phagen haben eine bis zu 1000 x höhere Transformationseffizienz als Plasmidvektoren.

Man kennt heute eine große Anzahl von Restriktions-Endonukleasen.

Restriktionsendonulease
Herkunftsorganismus
 Erkennungssequenz
(= Schnittstelle)

ECO RI

E.Coli RY13

GAATTC

Bam HI

Bacillus amyloliquefacies

GGATCC

Hind III

Haemophilus influenzae Rd

AAGCTT

Not I

Nicardia otitidis-Ca viarum

GCGGCCGC

Pst I

Providencia stuartii

CTGCAG

Oben sind einige Restriktionsenzyme aufgelistet. 1982 erzeugte man so das erste gentechnisch hergestellte Insulin und der erste Gentransfer eines menschlichen Wachstumsgens in eine Maus gelang. Ebenfalls erzeugte man die erste transgene Pflanze.

Nun benötigte man nur noch einen Methode, genügend viele Kopien bestimmter Gene zu erzeugen.

Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Mit Hilfe der Polymerase-Ketten-Reaktion (Polymerase chain reaction = PCR) kann man in ein paar Stunden Kopien von bestimmten DNA-Segmenten erzeugen. Mit RFLP mapping (= restriction fragment length polymporphism) werden bestimmte Muster in der DNA lokalisiert die das Gen eines Merkmals enthalten. Beide Methoden werden zur Herstellung des genetischen Fingerabdrucks verwendet. Die Methode wurde 1983 von Kary Mullis in Kalifornien erfunden (Nobelpreis 1993), Hoffmann-La Roche erwarb dann die Patente.

Die PCR Methode ist eine zyklische Reaktion mit 3 Hauptschritten, die 30-40 Mal wiederholt werden:

1. Denaturierung bei 95°C (1 Min) in einem Cycler, indem die Proberöhrchen in kurzer Zeit erhitzt und abgekühlt werden können. Dabei werden beide Stränge voneinander getrennt.

2. Hybridisierung bei ca. 54°C ( 45 Sec) mit einem ein Primer (20-30 Basen), komplementär zum gewünschten DNA-Abschnitt.

3. Polymerisierung bei 72 °C (2 Min) und Verlängerung des Komplementärstrangs durch eine hitzestabile Taq DNA- Polymerase ( aus Thermus aquaticus, einem thermophilen Bakterium aus heißen Quellen des Yellowstone National Parks).

Dabei werden von beiden Strängen exponentiell identische Kopien produziert. Zu Beginn ist eine Kopie des DNA-Strangs vorhanden, nach einem Zyklus 2, dann 4, dann 8 usw., nach 30 Zyklen sind 1 073 741 824 Kopien entstanden. Dies kann heute in ca. 15 Minuten erledigt werden.
Der Nachweis, wie die PCR abgelaufen ist erfolgt dann über eine Gelelektrophorese.

Der ladder ist ein Frgamentgemisch mit bekannten Fragmentgrößen, der als Marker für den Vergleich mit den PCR-Fragmenten dient. Der Abstand zwischen den verschiedenn Fragmenten des ladder ist logarithmisch.

Reihe 1 : Das PCR-Fragment ist ca. 1850 Basen lang.
Reihe 2 und 4 : Die Fragmente sind ca. 800 Basen lang.
Reihe 3 : kein Produkt vorhanden, PCR nicht erfolgreich.
Reihe 5 : multiple Banden werden gebildet, weil einer der Primer an verschiedenen Stellen sich anlagern konnte.

1985 erfolgte die erste Freisetzung genetisch manipulierter Bakterien ("ice-minus" Bacterien) in den USA, um Pflanzen vor Frost zu bewahren. In den USA werden genetisch manipulierte Pflanzen patentierbar.

1988 konnte der erste genetisch manipulierte Organismus käuflich erworben werden.  Bis heute wurden die verschiedensten transgenen Organismen erzeugt. Weiterhin begann das Human genome mapping Projekt mit dem Ziel bis zum Jahr 2005 das menschliche Genom komplett zu entschlüssseln. Inzwischen (2000) wurde das menschliche Genom parallel auch durch die US-Firma Celera vollständig entschlüsselt.

 

 

Abb. 128

Teosinte - Mais

 

Abb. 129

Pilzbefall beim Mais durch
Helminthosporium

 

Infektionszyklus

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Abb. 129

E. Coli Plasmid

Elmi-Bild von Plasmiden

 

 

Abb. 130

Transformation


Stanley Cohen

Er assistierte Herbert Boyer ab 1970 bei der Herstellung des ersten gentechnisch veränderten Organismus.

 

Abb. 131

Transformation

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Abb. 132

EcoR1 Restriktionsenzym

Herbert W. Boyer

Palindrom (von griechisch palíndromos = rückwärts laufend) ist ein Wort oder ein Satz, der von vorne und hinten gelesen gleich bleibt, z.B.

REGEN
NEGER

 

 

Abb. 133

DNA Methylierung


z.B. DNMT1 mit 1618 As.

 

 

Abb. 134

Cytosin Methylierung

Die Veränderung am Promotor durch Methylierung wird auch Epimutation genannt. Sie ist reversibel und verändert nicht die DNA-Sequenz.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Abb. 135

Synthese eines rekombinierten Plasmids

 

Abb. 136

Transgene Organismen

transgene Tabakpflanze mit dem Gen eines Leuchtkäfers für das Enzym Luziferase

 

Abb. 137

Bioluminszente Qualle
Aequoria victoria (Pazifik)

Das Licht, das die pazifische Qualle Aequorea durch mechanische Stimulation produziert ist ursprünglich bläulich, erscheint uns aber über eine gekoppelte Reaktion durch den Farbstoff GFP (= green fluorescent protein) grün.
Bitte gehen Sie mit der Maus über das Bild oben.

 

Abb. 138

Kary Mullis

Nobelpreis in Chemie 1993

 

Abb. 139

moderne PCR-Geräte

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Abb. 140

Ablauf der PCR

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Abb. 141

Gelelektrophorese der PCR-Produkte

 

Weiterführende Quellen:

Gentechnik

http://flybrain.neurobio.arizona.edu/
http://www.bll.de/
http://www.blueplanet.de/infonach/gentech.htm
http://arbl.cvmbs.colostate.edu/hbooks/genetics/biotech/index.html
http://online.sfsu.edu/~rone/GEessays/gedanger.htm
http://www.zum.de/Gentechnik/

Gentechnologie

http://www.gensuisse.ch/service/present.html
http://www.ndsu.nodak.edu/instruct/mcclean/plsc731/topic.htm
http://www.transgen.de/home/
http://library.thinkquest.org/19697/

Plasmide http://www.genomics.ceh.ac.uk/plasmiddb/
DNA-Methylierung http://www.clunet.edu/BioDev/omm/hhai/frames/methtx.htm#intro
Bakterielle Transformation http://www.rlc.dcccd.edu/mathsci/reynolds/micro/lab_manual/transformation.html
http://www.rickhershberger.com/bioactivesite/bio318/lab/transformation.htm
http://www.bio-rad.com/LifeScience/pdf/Bulletin_9563.pdf
http://www.biorad.com
Bioluminiszenz bei Quallen http://faculty.washington.edu/cemills/Aequorea.html
GFP http://www.nicol.ac.jp/~honma/chem10/gfp.html
http://pdbbeta.rcsb.org/pdb/explore.do?structureId=1EJ3
pUC19 http://www.fermentas.com/techinfo/nucleicacids/mappuc1819.htm
RFLP Mapping
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=mga.section.1720
Gelelektrophorese http://arbl.cvmbs.colostate.edu/hbooks/genetics/biotech/gels/agardna.html

Biotechnologie

http://www.biotech.wisc.edu/Education/

Genetik

http://vector.cshl.org/dnaftb/

Probleme und Risiken mit Gentechnologie

http://www.oeko.de/gentechnik.htm

Molekuarbiologische Methoden

http://come.to/biomedpage
http://www.msu.edu/user/delgadoi/Protocols.html

DNA-Learning Center

http://vector.cshl.org/

Animationen zu Gentechnologie

http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/animations.html