Transkription, Translation & Zentrifugation: Definition & Ablauf

1.2Replikation und Mitose
1.2.2  Semikonservative Replikation
Bevor sich eine Zelle teilt, muß sie ihre gesamte DNA verdoppeln
(= replizieren). In Eukaryonten geschieht das in der S-Phase des Zellzyklus.
Der Replikation genannte
Vorgang vollzieht sich gleichzeitig an mehreren Stellen des Riesenmoleküls
DNA. Dabei entstehen durch das Aufschrauben sogenannte Replikationsblasen.
Dort arbeiten 2 enzymatische Replikationskomplexe in entgegengesetzter
Richtung. Neben dem Enzym Helicase,
das die Doppelhelix entschraubt, enthält der Replikationskomplex
Gyrase, verschiedene Proteine,
Primase und verschiedene
DNA-Polymerasen. Die Replikation
verläuft in beiden Richtungen bis sich die Blasen treffen.


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Der sehr komplizierte und energieverbrauchende Vorgang läuft vereinfacht
in 3 Schritten ab:

  1. Entwindung und Stabilisierung der DNA
  2. Synthese eines komplementären DNA-Stückes in 5´-3´-Richtung
    am Führungsstrang
  3. Synthese von Okazaki-Fragmenten und deren Verbindung in 5´-3´-Richtung
    am anderen Strang
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1Initiatorproteine binden an die DNA.Das Enzym Helicase
bindet an die Proteine und entschraubt an der Stelle die Doppelhelix.
Die Gyrase und Proteine stabilisieren die entwundenen Einzelstränge.
2Die Primase synthetisiert ein Stück komplementäre
RNA-Nukleotide in 5´-3´-Richtung, kurz Primer
genannt. Nun bindet ein Molekül DNA-Polymerase
an den Primer und synthetisiert in 5´-3´-Richtung
mit Hilfe von Nukleotidtriphosphaten (dNTP) kontinuierlich
einen Komplementärstrang, der sich zur Helix formt. (=
Führungsstrang)
3Da die DNA Synthese nur in 5′ – 3′ ablaufen kann, wird ein
zweites DNA Polymerase- Molekül benutzt, um an den anderen
DNA-Strang zu bilden.

Auch hier werden wieder Primer verwendet. Die DNA-Polymerase synthetisiert
mehrere kleine komplementäre Polynukleotidsequenzen genannt Okazaki-Fragmente.
Eine zusätzliche Polymerase ersetzt die RNA-Primer durch DNA und ein
weiteres DNA-Polymeraseenzym prüft, ob bei der Synthese keine Fehler
gemacht wurden. Danach verknüft dann die DNA-Ligase die Okazaki-Stücke
zu einem kompletten Strang.

Geschwindigkeit der Synthese

Bei Prokaryonten ca. 1000 Nukleotide/Sekunde; d.h. bei E.Coli
mit 4,7 x 106 Basenpaaren dauert die Replikation 40 Minuten.

Eukaryonten:
Das typisch menschliche Chromosom hat ca. 150 x106 Basenpaare.
Die Synthese schreitet mit ca. 50 Nukleotiden/Sekunde voran. Dies würde
einen Monat dauern, gäbe es nicht gleichzeitig mehrere Replikationsblasen.
So dauert es nur eine Stunde. Die gesamte DNA mit 6 x 109 Basenparen
wird in mehreren Stunden verdoppelt.

AnDNAR_replexpDie Arbeit der Enzyme kann man in der obigen
und nebenstehenden Abbildung nachvollziehen.
Bei der Replikation der ringförmigen DNA in Prokaryonten findet
man nur eine Replikationsblase.

Semikonservative Replikation

semiconsDie oben beschriebene Art der Replikation wird von allen Organismen
durchgeführt. Dabei wird jeweils einer der alten DNA-Stränge
komplett belassen und ein komplett neuer komplementärer Strang
synthetisiert. Man nennt diese Methode semikonservative
Replikation
.

Matthew Meselson and
Franklin W. Stahl entwarfen 1958 ein Experiment, um zu entscheiden,
wie die DNA sich repliziert. Schon WATSON und Crick
hatten die semikonservative Replikation postuliert. Diese wurde
dann auch bewiesen.

  • Meselson und Stahl kultivierten E.Coli-Bakterien auf einem Nährboden,
    der als Stickstoffquelle 15N hatte. Die Bakterien bauten
    diesen in alle stickstoffhaltigen Stoffe ein, also auch in die DNA.
    Isolierte man die DNA und zentrifugierte sie im CsCl-Dichtegradienten
    bei 100000g, so ergab sich an einer bestimmten Stelle eine Bande der
    schweren DNA im Zentrifugenbehälter.
  • Die Zentrifugation von DNA von Bakterien, die auf 14N
    gewachsen waren ergab ein Bande leichter DNA an einer anderen Stelle.
  • Nun brachte man die 15N-Bakterien auf Nährboden mit
    14N, also mit normalen Stickstoffquellen und ließ sie
    1 Zellteilung durchführen. Wieder wurde die DNA der Bakterien analysiert
    und zentrifugiert. Es gab nur eine halbschwere Bande, die genau in der
    Mitte der beiden ersten Banden lag. Das Ergebnis nach 2 Zellteilungen
    ergab zur Hälfte leichte und halbschwere DNA, nach 3 Generationen
    3/4 leichte und 1/4 halbschwere DNA.

Dieses Ergebnis konnte nur durch semikonservative
Replikation der Bakterien-DNA erklärt werden
.

Das Experiment ist auf der nachfolgenden Tafel zusammengestellt:

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Ein Shockwave-Animation der Replikation ist hier zu sehen:
http://www.ncc.gmu.edu/users/ypetty/repanim.htm

Zentrifugation

Eine Zentrifuge ist ein Gerät, um Teilchen aus einer Lösung
gemäß ihrer Größe, Form und Dichte und der
Viskosität des Mediums und Rotorgeschwindigkeit zu trennen.
In der Biologie sind das Zellen, Organellen, Viren und große
Moleküle wie Nukleinsäuren und Proteine. Die Grundlagen
der Sedimentation gehorchen dem Stokeschen Gesetz. Es gibt
verschiedene Formen der Zentrifugation.

_zonevelBei der Dichtegradienten-Zentrifugation wird das Partikelgemisch
in Banden aufgetrennt. Die Sedimentationsgeschwindigkeit unter
definierten Bedingungen wird als Sedimentationskoeffizient
nach Svedberg angegeben (s). Dabei gilt:

_stokes2d = Moleküldichte
do
= Dichte des Gradienten;

r = Molekülradius

S = Sedimentationskoeffizient
oder 10
-13
sec;
C = Zentripetalkraft
V = Sedimentationsgeschwindigkeit;
n = Viskosität
des Mediums

Bei Proteinen ist s < 20, Ribosomen der Eukaryonten besitzen
s = 80 (oder 80s), s Influenza-Virus = 600 und s Mitochondrien >
8000.

 

1.3Transkription, Translation
1.3.1Realisierung der genetischen Information
Neben der Nukleinsäure DNA als Träger der Erbinformation ist noch RNA (= Ribonukleinsäure) an den molekularen Prozessen um die Erbinformation beteiligt. Sie kommt in der Zelle in 3 Formen vor:

  1. m-RNA = Messenger-RNA oder Boten-RNA
  2. t-RNA = transfer-RNA
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