Genetischer Fingerabdruck: Defintion, Str Methode & Durchführung (Abnahme)

1.6 Gentechnologie
III
Gentechnische
Methoden, gentechnisch hergestellte Medikamente, Gentherapie

DNA Fingerprinting

Mit dem genetischen Fingerabdruck
oder der DNA-Fingerprintmethode können DNA-Spuren aus verschiedenen
Quellen miteinander verglichen werden. Es gibt verschiedene Methoden darunter
ist die Methode basierend auf VNTR
Polymorphismus (Polymorphismus = multiple Allelie) weit verbreitet. Ein
Allel ist eine bestimmte Genvariante.
Der Mensch kann von bestimmten Genen unterschiedliche Varianten besitzen,
z.B. gibt es verschiedene Allele der Gene für die Haarfarbe. Zwischen
den Genen sind in den Chromosomen nichtcodierende Abschnitte enthalten,
innerhalb Genen eingestreut nennt man diese INTRONS.

strfp - Genetischer Fingerabdruck: Defintion, Str Methode & Durchführung (Abnahme)

Sie enthalten neben abgeschalteten Pseudogenen, die ihre
Funktion verloren haben und als “evolutionärer Ballast”
erhalten geblieben sind, überwiegend DNA-Abschnitte, die sich aus
Blöcken sich wiederholender “repetitiver” Sequenzen zusammensetzen.
Diese werden je nach Länge der Repetitivsequenz als Minisatelliten
(Multi- und Einzellokus-Systeme, typische Repeatlänge 15-50 Basen)
oder VNTRs (=Variable-number-of-tandem-repeats)
genannt. Daneben gibt es auch Mikrosatelliten (Länge 2-5 Basen),
die man als STR-Systeme (STR = Short
Tandem Repeats), bezeichnet. Während bei Minisatelliten über
100 Repeats hintereinander liegen können, so findet man bei STR’s
typischerweise zwischen 8 und 25 Wiederholungen.

Darin unterscheiden sich alle Individuen.

codis - Genetischer Fingerabdruck: Defintion, Str Methode & Durchführung (Abnahme)

Bei der DNA-Identifizierung durch das FBI wird die Polymerase
chain reaction (PCR) Verstärkung
von 4 Basen langen STR Sequenzen verwendet. Das FBI hat seine Methode
CODIS genannt für “Combined DNA Index System”. Das CODIS
System der Personenidentifikation nutzt 13 STR Loci im menschlichen Genom.

bka_str - Genetischer Fingerabdruck: Defintion, Str Methode & Durchführung (Abnahme)

Neben der Identität von Personen kann man durch
die DNA-Fingerprintanalyse auch über deren Abstammung
Informationen erhalten. Im einfachsten Fall handelt es sich um den Nachweis
der direkten Elternschaft, in Form eines Vaterschaftstests. Bei Nicht-Übereinstimmung
bestimmter genetischer Muster kann eine Eltern-Kind-Verwandtschaft mit
Sicherheit ausgeschlossen werden. Prominentes Beispiel,das öffentliches
Aufsehen erregte, war die Widerlegung der Behauptung von Anne
Anderson
, die verschollene Zarentochter
Anastasia
zu sein, ebenso wie der Fall Kaspar
Hauser
, dessen Herkunft aus dem Haus Baden anhand von Blutspuren
auf seiner Kleidung ausgeschlossen werden konnte.

Genealogen (Stammbaumforscher) können mit Hilfe
von mtDNA (= mitochondrialer DNA)
die mütterlichen Linien verfolgen und mit dem Y-Chromosom
die väterliche Linie. Genetische Unterschiede zwischen menschlichen
Populationen sind normalerweise für das Y Chromosom größer
als für die mtDNA.

strym - Genetischer Fingerabdruck: Defintion, Str Methode & Durchführung (Abnahme)

Dabei werden wieder bestimmte genetische Marker auf der
entsprechenden DNA verwendet. So kann man von Großeltern bis 10
000 Jahre zurück schließen.

ymtdna - Genetischer Fingerabdruck: Defintion, Str Methode & Durchführung (Abnahme)

Mitochondrien werden
nur durch die Eizelle ( mütterliche Linie) weitergegeben. Die Mitochondrien
der Spermatozoen sind zur Zerstörung markiert und werden nach der
Befruchtung zur Zygote bis zum 4-Zellstadium abgebaut.

befru - Genetischer Fingerabdruck: Defintion, Str Methode & Durchführung (Abnahme)

Die Eizelle in Säugetieren enthält ca. 100,000
mtDNA-Moleküle, eine Spermienzelle ca. 100–1500 mtDNAs. Da Mitochondrien
kein DNA-Reparatursystem enthalten, gibt es eine viel höhere
Mutationsrate (
ca. 10-7
Mutationen pro bp pro Generation) als im Kern-Genom ( ca. 2 x 10-8
pro bp pro Generation). Jede Zelle enthält hunderte Mitochondrien
mit ca. 2 -10 mtDNA-Kopien. Normalerweise sind alle mtDNAs in einer Zelle
identisch (= Homoplasmie).
Die ungefähre Anzahl an Unterschieden in Basenpaaren zwischen 2 menschlichen
mtDNAs werden auf 9.5 bis 66 geschätzt (Zeviani et al. 1998). Die
hohe Mutationsrate führte zu einer großen Anzahl populationsspezifischer
Basensubstitutionen.

mtdna - Genetischer Fingerabdruck: Defintion, Str Methode & Durchführung (Abnahme)

Das “Human Genome Project”, ein weltweites
Forscher-Konsortium veröffentlichte seit 1981 die komplette Sequenz
der menschlichen mitochondrialen DNA (mtDNA). Diese wurde als “Cambridge
reference sequence” (CRS) bekannt
und 1999 resequenziert und Fehler beseitigt. Inzwischen hat man mehrere
hundert (560) verschiedene mitochondriale Genome verschiedener menschlicher
Populationen sequenziert und fand verschiedene Mutationen und Polymorphismen.
Derzeit ist man dabei herauszufinden, welche Veränderungen zu welchen
Krankheiten führen. Als erster Schritt wird jede neue Sequenz mit
den anderen und der CRS verglichen.

Verglichen mit dem menschlichen Genom mit seinen 3 Milliarden
DNA-Bausteinen ist das mitochondriale Genom mit seinen 16500 Basenpaaren
winzig. Jede der 560 Sequenzen wurde klassifiziert und anhand der Muster
der Polymorphismen (Haplotypen)
die prähistorische Wanderung der Menschen rekonstruiert.

Dabei ist wichtig, daß die mitochondriale DNA keiner
Rekombination
wie z.B. bei der Meiose unterliegt ( also Austausch
von Chromosomenstücken der beiden homologen Chromosomen). Es gibt
auch keine Introns wie bei der eukaryontischen
DNA nur im sog. D-Loop (=displacement-Loop) 2 nichtcodierende Sequenzen,
einer Region von 1121 bp, die den Replikationsursprung und die Promotoren
für die Transkription enthalten.

Es gibt 2 Bereiche der mtDNA, die für die Wissenschaftler
besonders interessant sind, da sich hier die Variabilität innerhalb
der menschlichen Population zeigt. Diese werden HVR1 und HVR2 (=hypervariable
segments) bezeichnet.

Die grundsätzlichen Haplogruppen werden mit Großbuchstaben
bezeichnet. Ca. 76% aller afrikanischen
mtDNA
s fällt in den Haplotyp L, 77% der asiatischen
mtDNA
s fallen in die Gruppen A, B, C, D, E, F, G, M, P, Q und Z.
In Amerika findet man die Haplogruppen
A, B, C, D, und X, die Haplotypen H, I , J, K, T, N, U, V, W und X in
West-Eurasien. In Australien und Ozeaneien gibt es nur die Haplotypen
M und N.

mig - Genetischer Fingerabdruck: Defintion, Str Methode & Durchführung (Abnahme)

Mit einer Mutationsrate von 1 in 10 000 Jahren konnte
festgestellt werden, daß jeder in Europa von nur 7 Frauen abstammt.
Diese kamen während der letzten 45,000 Jahre zu verschiedener Zeit
nach Europa und überlebten. Man nannte sie die 7 Töchter der
Eva: Ursula, Xenia, Tara, Helena, Katrine, Valda and Jasmine nach Prof.
Sykes Uni Oxford.

Weiter konnte festgestellt werden, daß alle
lebenden Menschen aus einer mütterlichen Quelle stammen, die vor 100
000 bis 200 000 Jahren in Afrika lebte. Ähnliches ergab sich durch
die Analyse des Y-Chromosoms. Alle Männer stammen von einem Vorfahren
aus Afrika ab, der dort zur selben Zeit lebte.

Die Analyse der mtDNA aus verschiedenen Neanderthalknochen
ergab keine Rekombination zwischen dem modernen Menschen und Neanderthalern.
Sie lebten tausende von Jahren parallel.

Durchführung des genetischen Fingerabdrucks

854795 - Genetischer Fingerabdruck: Defintion, Str Methode & Durchführung (Abnahme)

Weitere gentechnische Methoden

  • Hybridisierung isolierter Einstrang-DNA mit radioaktiven
    Proben
  • Gentherapie
hybrid5k - Genetischer Fingerabdruck: Defintion, Str Methode & Durchführung (Abnahme)gentherk - Genetischer Fingerabdruck: Defintion, Str Methode & Durchführung (Abnahme)

Gentechnisch hergestellte Medikamente

Erythropoietin
(EPO), ist ein Glycoprotein-Hormon (165 As), das hauptsächlich in
der Niere (aber auch den Hepatozyten der Leber) von Blutgefäßzellen
des peritubulären Kapillarnetz und für die Regulation der roten
Blutkörperchen (Erythrozyten) verantwortlich ist. Die EPO-Produktion
wird durch den O2-Gehalt in den Nierenarterien stimuliert.

epo4 - Genetischer Fingerabdruck: Defintion, Str Methode & Durchführung (Abnahme)

epo2 - Genetischer Fingerabdruck: Defintion, Str Methode & Durchführung (Abnahme)

Auf diese Weise wird die Zahl der Erythrozyten
wieder aufgefüllt. Die Primärwirkung von
EPO
funktioniert nach dem Andocken an 2 Membranrezeptoren (EpoR) der Stammzellen
im Knochenmark über eine
MAP-Kinase-Kaskade,
Phosphorylierung des Stat5-Transkriptionsaktivators, Dimerisierung und
Genaktivierung von Zielgenen, die die Reifung zu Erythrozyten bewirken.

Die Stärke der EPO-Wirkung hängt von der Größe
der Anämie (Blutarmut) oder
Hypoxie (Sauerstoffunterversorgung)
ab. Normalerweise wird bei einer Hämoglobin-Konzentration von mehr
als ~12 g/dl (7.5 mmol/l) kein EPO ausgeschüttet. Fällt die
Hb-Konzentration unter 12 g/dl (7.5 mmol/l), steigt die EPO-Ausschüttung
stark an.

Um die Bildung der Erythrozyten anzuregen und damit der
Anämie entgegenzuwirken, wird heute neben der Gabe von Eisen zur
Hämoglobin-Synthese mit Erfolg rekombinantes Erythropoietin (rhEPO)
eingesetzt. Es entspricht im Aufbau und in der Zusammensetzung dem natürlichen
EPO. Rh-EPO wurde wird durch rekombinante DNA-Technologie aus einer Phagen-Bibliothek
isoliert in Ovarzellen des Chinesischen Hamsters (CHO) mit einer Reinheit
von > 98% hergestellt. (Test durch RP-HPLC=Hochleistungsflüssigkeits-Chromatographie
)

Das Gen, das für das menschliche EPO codiert wurde
1985 geklont und für die gentechnische Herstellung von rekombinanten,
menschlichen EPO (rhu-EPO) verwendet.
Rh-EPO wurde inzwischen bei vielen verschiedenen Krankheitssituationen
wie z.B. der Anämie bei Nierenversagen oder bei HIV-Patienten , die
mit AZT behandelt worden sind bzw. bei der Anämie im Falle einer
Krebs-Chemotherapie.

Relativ bekannt in der Öffentlichkeit wurde es durch
Dopingfälle beim Radsport. Das Internationale Olympische Komitee
(IOC) verbietet seit ca. 12 Jahren den Gebrauch von EPO. Der direkte Nachweis
von rhEPO basiert auf der isoelektrischen Fokussierung (IEF) von Urinkonzentraten.
Grundlage des Tests ist die Unterscheidung von humanem EPO (hEPO), das
der menschliche Organismus selber synthetisiert und von rekombinantem
EPO (rhEPO), das gentechnisch hergestellt wird und als körperfremdes
EPO zu betrachten ist.

Gentherapie bei Mukoviszidose

Cystische Fibrose
(CF = Mukoviszidose) ist eine der schlimmsten Erbkrankheiten, die durch
die Vererbung eines defekten, rezessiven autosomalen Gens auf Chromosom
7 entsteht. Die ungefähre Lebenserwartung der ca. 8000 Patienten
in Deutschland beträgt weniger als 30 Jahre. Das für die Cystische
Fibrose verantwortliche Gen codiert für das CFTR -Protein (= transmembrane
conductance regulator).
CFTR
ist ein durch cAMP geregelter Cl- Ionenkanal in den apikalen Membranen
von sekretorischen Zellen. (Lunge, Bauchspeicheldrüse usw.)

cf5 - Genetischer Fingerabdruck: Defintion, Str Methode & Durchführung (Abnahme)

Mutationen im CTFR-Protein unterbrechen den epithelialen
Ionentransport im Lungen- und Bauchspeicheldrüsengewebe und können
zu Atemversagen, Pankreas Insuffizienz und anderen Defekten führen.
Neben der konventionellen Therapie zur Linderung der Symptome wird seit
der Entdeckung der genetischen Ursache und des Gendefekts der CF 1989
bis heute intensiv an einer Gentherapie
geforscht.

Da die CTFR-Ionenkanäle in verschiedenen Epithel-
und Drüsenzellen ausgebildet werden ist es schwierig, mit der derzeitigen
Technik durch Gentherapie die natürliche Wirkung der CF-verursachenden
Gene wiederherzustellen.

Ca. 70% der CF-Patienten weisen eine bestimmte Mutation
im CTFR auf. Hier fehlt die Aminosäure Phenylalanin in Position 508
des Proteins, weshalb die Mutation den Namen Delta-F-508
erhielt. Dies führt zu einem räumlich deformierten CFTR-Protein
ohne Tunnelfunktion. Inzwischen sind über weitere 700 Genveränderungen
bekannt, die mit dem Krankheitsbild der Mukoviszidose einhergehen.

deltaf508 - Genetischer Fingerabdruck: Defintion, Str Methode & Durchführung (Abnahme)

Als möglicher Vektor für die Gentherapie steht
das Adenovirus mit seiner Fähigkeit,
spezifisch Atemwegsepithelien zu infizieren, zur Debatte. Das Virus wird
durch das Entfernen einer bestimmten Region seiner DNA replikationsunfähig
gemacht. An dieser Stelle wird eine Expressionskassette eingebaut, in
der ein Promotor die eingesetzte CFTR-DNA antreibt. Das Virus bindet zunächst
an spezifische Rezeptoren der Epithelzellen, die sog. Coated pits, über
die es per Endocytose in die Zelle gelangt. Dort wird es als fremd erkannt
und zum Endosom verpackt. Dadurch gelangt es in den Zellkern hinein und
verliert dort seine Proteinhülle. So konnte sowohl in vitro als auch
in vivo an Ratten die fehlende CFTR-DNA in Bronchialepithelien übertragen
werden. Die virale DNA mit dem CFTR-Promotor liegt im Zellkern neben den
Chromosomen und wird dort exprimiert. In klinischen Studien an CF-Patienten
stellte sich der Erfolg leider noch nicht ein, bei Mäusen gelang
gelang es jedoch.

 


Abb. 167
 

Allele
Gen-Polymorphismus

 

alle3 - Genetischer Fingerabdruck: Defintion, Str Methode & Durchführung (Abnahme)

 


Abb. 168
 

STR-Polymorphismus

 

str3 - Genetischer Fingerabdruck: Defintion, Str Methode & Durchführung (Abnahme)

Quelle: Proc. Int. Sym.Hum. (Promega)
1997, p.34

 

 

 


Abb. 169
 

STR Loci
für CODIS (FBI)

 

In der deutschen Kriminaltechnik werden zur zeit 8 STR-Loci für
die BKA-Datenbank verwendet: TH01, D21S11, SE33, FGA,
vWA, D18S51, D8S1179 und D3S1358 bei denen die Wiederholungseinheit
jeweils aus 4 Basen besteht, analysiert. Die 8 STR-Loci-DNA-Merkmalsmuster
treten in der mitteleuropäischen Bevölkerung zufällig
statistisch etwa 1 mal je 1 Milliarde bis 1 Billion Personen auf.

 

 

 

 

 

 

 


Abb. 170
 

STR-Locus
TH01

 

Verwendung durch deutsche Kriminalbehörden

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


Abb. 171
 

STR Loci
auf dem Y-Chromosom

 

 

STR-Genloci auf dem Y-Chromosom werden für die Analyse von
Stammbäumen verwendet um die Verwandschafts-verhältnisse
verschiedener menschlicher Populationen herauszubekommen.

Mittels DNA-Analysen (u.a. mit einer Blutprobe des britischen Throngemahls
Prince Phillip) gelang es herauszufinden, dass die fehlende Zarentochter
im Grab Maria war und nicht Anastasia.

Weitere DNA-Analysen ergaben, dass die angebliche Anastasia eine
Polin mit dem Namen Franziska Schanzkowski war.

anast - Genetischer Fingerabdruck: Defintion, Str Methode & Durchführung (Abnahme)

Stammbaum
der Romanows

 


Abb. 172
 

Vererbung
in mütterlichen und väterlichen Linien

 

 


Abb. 173
 

Vererbung
der Mitochondrien

 

 


Abb. 174
 

Spermium

 

sperm7 - Genetischer Fingerabdruck: Defintion, Str Methode & Durchführung (Abnahme)

 


Abb. 175
 

mtDNA
Mensch

 

Genkarte der menschlichen mtDNA.

Protein-codierende Gene (fett) sind außerhalb des Kreises
markiert und beinhalten 7 Untereinheiten der NADH Dehydrogenase-Coenzym
Q Oxidoreductase (ND), eine Untereinheit der Coenzym Q-Cytochrom
c Oxidoreductase (Cyt b), drei Untereinheiten der Cytochro- c-Oxidase
(CCO), und zwei Untereinheiten der ATP Synthase (A). Weiterhin findet
man zwei ribosomale Gene (12S and 16S rRNAs, und 22 tRNAs [one-letter
code]). Mutationen in der mtDNA im Zusammenhang mit verschiedenen
Krankheiten ( MELAS, MERRF, Ataxia, Chorea, Dystonia, Motor Neuron
Disease (MND) und Parkinson sind eingerahmt. Auch Migräne wird
in Zusammenhang mit mitochondrialen Defekten gebracht.

 

 

 

 

 

 

 


Abb. 176
 

Wanderung prähistorischer Menschen

 

migy - Genetischer Fingerabdruck: Defintion, Str Methode & Durchführung (Abnahme)

 


Abb. 177
 

Homo sapiens sapiens
Homo sapiens neanderthalensis

 

hnhs - Genetischer Fingerabdruck: Defintion, Str Methode & Durchführung (Abnahme)

 


Abb. 178
 

Durchführung
des genetischen Fingerabdrucks

 

 

 

 

 

 

 

 


Abb. 179
 

genetische
Methoden

 


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Abb. 180
 

chinesischer
Hamster
(
Cricetulus griseus)

 


CHO7 - Genetischer Fingerabdruck: Defintion, Str Methode & Durchführung (Abnahme)DiOC6 = Fluoreszenzfarbstoff zur Anfärbung von Zellorganellen;
zelluläre Membranen sind grün gefärbt 

 


Abb. 181
 

Epo mit
Regelkreis

 

 


Abb. 182
 

Primärwirkung
EPO

 

pwepok - Genetischer Fingerabdruck: Defintion, Str Methode & Durchführung (Abnahme)

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Abb. 183
 

Blutdoping
mit EPO

 

rad - Genetischer Fingerabdruck: Defintion, Str Methode & Durchführung (Abnahme)

Radsport, Eisschnelllauf und viele andere Sportarten sogar Fußball
werden immer wieder mit dem Blutdoping durch EPO in Verbindung gebracht.

Die Fußballmannschaft von Juventus Turin mit Vialli, Roberto
Baggio, Del Piero und Zidane ist in den neunziger Jahren systematisch
gedopt worden. Die veröffentlichte schriftliche Begründung
des Urteils gegen den Teamarzt, der im November 2004 in Turin mit
20 Monaten Gefängnis bestraft wurde, belegt diesen Sachverhalt.

 

 


Abb. 184
 

Symptome
der Cystischen Fibrose

 

 

autosomal
=
Nicht-Geschlechtschromosomen

rezessiv
=
Defektgen kann bei Eukaryounten wegen der Diploidie durch ein gesundes
Gen auf dem homologen Chromosom in seiner Auswirkung überdeckt
werden.

ctfrek - Genetischer Fingerabdruck: Defintion, Str Methode & Durchführung (Abnahme)

CTFR-Cl – Kanal

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Abb. 185
 

typische
Mutation bei CF

 

CTFRk - Genetischer Fingerabdruck: Defintion, Str Methode & Durchführung (Abnahme)

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Abb. 186
 

Delta-F-508
– Mutation

 

 

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