Gentechnologie: Plasmidtransfer, Restriktionsenzyme, Klonierung, DNA-Hybridisierung

In den letzten 20 Jahren haben die Wissenschaftler entdeckt, daß
DNA (Gene) zwischen den Organismen austauschbar sind, egal ob Bakterium,
Pilz, Pflanze oder Tier.Bisher hat der Mensch durch Züchtung und Auswahl Tiere oder Pflanzen
mit gewünschten Eigenschaften versehen, nun kann er mit Hilfe der
Erkenntnisse der Molekularbiologie durch gezielten Gentransfer die Organismen
mit Merkmalen ausstatten. Man nennt ein Lebenwesen, das DNA gentechnisch
von einer anderen Quelle erhalten hat transgen.

Definition Biotechnologie:
Einsatz biologischer Systeme im Rahmen technischer Prozesse und
industrieller Produktionen.Definition Gentechnologie:
Anwendung moderner molekularbiologischer Methoden zur Änderung
der genetischen Eigenschaften von Organismen. Man sagt dazu auch”rekombinante
DNA-Technologie”, weil damit Erbinformation gezielt re- bzw.
neukombiniert werden kann.

Geschichte der Gentechnologie

Die Geschichte der Gentechnologie reicht 8000 und mehr Jahre zurück,
als die Ureinwohner Amerikas eine heimische Pflanze namens Teosinte
domestizierten. Genetische Studien belegen dies (nach Prof. Doebley und
W. Galinat). C. Columbus war der erste Europäer, der des Ergebnis
indianischer Gentechnik zu sehen bekam.

_2000001_3Sie benutzten schon damals die Technik des “Genetic Engineering”,
um ertragreichere Spezies zu züchten.Von der Teosinte (links) mit kleinen Körnern existieren 2
Mutanten mit großen Körnern. Die Ureinwohner kreuzten
die beiden Mutanten und erhielten den

Fruchtstand des Mais mit noch größeren festsitzenden Körnern.

_4000000Der Grund für die Kreuzung ist unten links zu sehen. Durch
die Kreuzung erhielt man eine Rekombinante mit der vierfachen Samenanzahl
wie die Teosinte. Die Rekombinante enthält auf Chromosom 2
eine Genverdopplung (Duplikation). Doch mit der Ertragssteigerung
nicht genug.Wie auch heute können natürliche Feinde die ganze Arbeit
an einer Monokultur zunichte machen. Betrachtet man ein Getreidefeld
aus der Sicht der Ökologie, so ist das Anlegen einer Monokultur
ein Eingriff in die Nahrungskette. Die von der Getreidepflanze abhängigen
anderen Arten wie Pilze und Insekten nehmen aufgrund des Überangebotes
an Nahrung oder Lebensraum drastisch zu und vermindern damit aber
den Ertrag. Unten links sind Getreideblätter (a,b) zusehen,
die mit dem Pilz Helminthosporium maydis befallen sind. Dadurch
können ganze Ernten vernichtet werden.
_7000001Es gibt allerdings auch Pflanzen, die gegen den Pilzbefall resistent
sind (c). Sie bilden ein Gift, das den Befall verhindert. Schon
die amerikanischen Ureinwohner isolierten diese resistenten Pflanzen
und züchteten sie weiter. Weiterhin hat man resistente Varietäten
mit Pilz-empfindlichen Arten gekreuzt, um resistente, ertragreiche
Arten zu erhalten. Das so heute erhaltene Produkt, der Mais ist
also die Arbeit von über 8000 Jahre Züchtung und Auslese.

Aufgrund unsere heutigen genetischen Kenntnisse wissen wir, daß
der Mais durch Duplikation und mutierte Gene entstanden ist und außerdem
das Genom durch Kreuzung mit zusätzlichen Resistenzgenen vergrößert
worden ist. Die neuen Eigenschaften des Organismus sind also durch Ändern
und Hinzufügen von DNA (Genen) erreicht worden. Dies hat ca. 8000
Jahre gedauert. Man suchte nun eine Möglichkeit, die Integration
von DNA mit gewünschten Eigenschaften schneller und einfacher zu
erreichen.

pbr322Bei der Suche nach geeigneten Methoden erinnerte man sich an die
Eigenschaften der Plasmide, kleinen DNA-Ringen in Bakterien
mit spezifischen Genen für Antibiotika-Resistenz und -Produktion
und anderen Eigenschaften. Auf Plasmide war man bei der Erforschung
der Ursachen der Resistenz von Bakterien gestoßen. Plasmide
replizieren sich unabhängig von der Haupt-DNA durch eine bestimmte
Nukleotidsequenz, die in Nachbarschaft z.B. der Resistenzgene liegt.Solche selbständigen DNA-Einheiten wie die Plasmide sind
also die richtige Transporteinheit für Gene in Zellen.

Oben ist das E.Coli-Plasmid pBR322 abgebildet. pBR322 DNA wird
aus E.coli (dam+, dcm+) isoliert, per Ultrazentrifugation durch einen
Cäsiumchlorid-Gradienten in Gegenwart von Ethidiumbromid greinigt.
Das Moleküle ist doppelsträngig, ringförmig und hat 4361
Basenpaare. Die eingezeichneten Stellen sind alles Nukleotidpositionen,
wo bestimmte Restriktionsenzyme (siehe unten) spalten. Das Plasmid
enthält 2 Resistenzgene (Markergene)
gegen Ampicillin und Tetrazyklin.

Bei der Erforschung der Viren (zwischen 1950 und 1960) hatte
man gelernt, daß bei der Infektion und Lyse einer Zelle hunderte
von genetisch identischen Exemplaren entstehen, alle Klone
des einen infizierenden Partikels.

_transfoEine Eigenschaft von Bakterien, die man zuerst bei E.Coli entdeckt
hatte, war eine weiterer Baustein für den künstlichen
Transfer von DNA in Zellen.

_cohenIn Stanley Cohens Labor fand man heraus, daß
CaCl2 die bakterielle Zellwand und Membran durchlässig
machte, sodaß DNA aufgenommen

werden konnte. Auf diese Weise schaffte man es, Plasmid-DNA mit
Resistenzgenen in ein nicht resistentes Bakterium einzuschleusen.

Da sich die Bakterien mit dem aufgenommenen DNA-Stück identisch
replizierten, konnte man so Millionen Kopien des Resistenzplasmids erzeugen.
Dies war seit 1971 ein wichtiger Schritt auf dem Weg des “Genetic
Engineering”
. Heute benutzt man neben der Transformation
noch die Elektroporation oder Mikroprojektile (siehe unten),
um DNA in die Zellen zu befördern.

Um das Prinzip der DNA-Aufnahme in Zellen genauer zu verstehen, untersuchte
man die Plasmide weiter. Vielleicht konnten neben den Resistenzgenen noch
andere eingeschleust werden. Dazu war eine Methode nötig, DNA-Stücke
(Gene) zu verbinden. Man kannte die DNA-Ligase, die bei der Replikation
DNA-Sequenzen verbinden konnte.

restr1Ein weiterer Meilenstein in diesem Zusammenhang war die Entdeckung
der Restriktions-Endonukleasen
wie z.B Eco R1 durch Herbert W. Boyer.
Diese Enzyme konnten bestimmte Sequenzen erkennen (GAATTC) und (CTTAAC)
und dort die DNA auf spezielle Art durchschneiden. In Bakterien
dienen sie als Schutz gegen Viren. Die Wirkung dieser Enzyme wird
links an EcoR1 gezeigt. Restriktionsenzyme umgeben die DNA
an der Erkennungsstelle. (hier GAATTC)
Ein Strang der DNA wird an einer Stelle und der andere an
einer anderen Stelle, zwischen G und A durchgeschnitten. Die getrennten
Stücke haben einen kurzen

einsträngigen Abschnitt genannt klebrige
Enden
. Ein anderes DNA-Stück mit ebenfalls einem
klebrigen Ende kann sich mit dem komplementären Ende verbinden. Die
neu gepaarten DNA-Stücke werden durch Ligase verbunden. Bei
einem Plasmid sieht das so aus:

M095utdsHeute gibt es viele Plasmide zum molekularen Klonen , die aus
rekombinierten Fragmenten verschiedener natürlicher Plasmide
künstlich hergestellt wurden. Sie enthalten zahlreiche Stellen
für verschiedene Restriktionsenzyme.Das synthetische Plasmid pUC19 enthält_puc19i0

unter anderem im

b-Galactosidase-Gen einen Geneinschub, um Gene
mit bestimmter Länge zu transportieren.
Aus diesem Grund spricht man auch bei Plasmiden von Vektoren. Das

b-Galactosidase-Gen ist durch den künstlichen
Geneinschub inaktiviert.

Neben den Plasmiden setzt man heute noch andere Vektoren ein:

  • Bakteriophagen
  • Cosmide
  • künstliche Chromosomen bei Hefe (YACs)
  • künstliche Chromosomen bei Bakterien (BACs)

Vector

Einbaugröße (kb)

Plasmid

<10 kb

Bacteriophage

9-20 kb

Cosmids

33-47 kb

BACs

75-125 kb

YACS

100-1000 kb

Die Einbaugrößen der DNA-Fragmente in kb=Kilobasen sind oben
angegeben.

Man nennt das Durchschneiden der DNA mit Restriktions-Enzymen und das
Aufspüren durch radioaktive Proben per Gelelektrophorese und Autoradiogramm
Southern Blot.

Cosmide sind Plasmid-Vectoren die
cos-Sequenzen enthalten. Diese sind für die Integration in Phagen
notwendig.

Man kennt heute eine große Anzahl von Restriktions-Endonukleasen.


Restriktionsendonulease

Herkunftsorganismus

 Erkennungssequenz (=
Schnittstelle)
ECO RIE.Coli RY13GAATTC
Bam HIBacillus amyloliquefaciesGGATCC
Hind IIIHaemophilus influenzae RdAAGCTT
Not INicardia otitidis-Ca viarumGCGGCCGC
Pst IProvidencia stuartiiCTGCAG

Oben sind einige Restriktionsenzyme aufgelistet. 1982 erzeugte man so
das erste gentechnisch hergestellte Insulin und der erste Gentransfer
eines menschlichen Wachstumsgens in eine Maus gelang. Ebenfalls erzeugte
man die erste transgene Pflanze.

Nun benötigte man nur noch einen Methode, genügend viele Kopien
bestimmter Gene zu erzeugen.

Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Mit Hilfe der Polymerase-Ketten-Reaktion (Polymerase chain reaction = PCR) kann man in ein paar Stunden Kopien von bestimmten DNA-Segmenten erzeugen. Mit RFLP mapping (= restriction fragment length polymporphism) werden bestimmte Muster in der DNA lokalisiert die das Gen eines Merkmals enthalten. Beide Methoden werden zur Herstellung des genetischen Fingerabdrucks verwendet. Die Methode wurde 1983 von Kary Mullis in Kalifornien erfunden (Nobelpreis 1993), Hoffmann-La Roche erwarb dann die Patente.

Die PCR Methode ist eine zyklische Reaktion, bei der ein DNA-Strang
30 Sekunden bei 90-95 °C hitzedenaturiert wird, um beide Stränge
voneinander zu trennen. Dann wird auf 55°C abgekühlt und ein
Primer (20-30 Basen), komplementär zum gewünschten DNA-Abschnitt
angebracht. Der Zyklus endet mit der Verlängerung durch eine hitzestabile
Taq DNA- Polymerase ( aus Thermus aquaticus, einem thermophilen
Bakterium aus heißen Quellen des Yellowstone National Parks) bei
75°C, wobei identische Kopien produziert werden. Der ganze Vorgang
kann bis zu 30 Mal wiederholt werden, wird heute in speziellen Maschinen
durchgeführt und liefert dabei in ca. 3 Stunden 1 Million DNA-Kopien.

_polyme0

1985 erfolgte die erste Freisetzung genetisch manipulierter Bakterien (“ice-minus” Bacterien) in den USA, um Pflanzen vor Frost zu bewahren. In den USA werden genetisch manipulierte Pflanzen patentierbar.

1988 konnte der erste genetisch manipulierte Organsimus käuflich
erworben werden.  Es wurden transgene Mäuse erzeugt. Weiterhin
begann das Human genome mapping Projekt mit dem Ziel bis zum Jahr
2005 das menschliche Genom komplett entschlüssselt zu haben. Inzwischen
(2000) wurde das menschliche Genom parallel auch durch die US-Firma Celera
vollständig entschlüsselt.

Weiterführende Quellen:

Gentechnikhttp://flybrain.ub.uni-freiburg.de/Skriptum/Gentechnik/Einleitung.html
http://www.bll.de/
http://www.blueplanet.de/infonach/gentech.htm
http://www.bayern.de/STMLU/gen/
http://www.biotechmobil.de/anwend6.htm
Gentechnologiehttp://biology.anu.edu.au/Groups/Plantsc/gt.htm
http://www.ndsu.nodak.edu/instruct/mcclean/plsc731/topic.htm
http://hyperion.advanced.org/18258/noframes/intro.htm
Biotechnologiehttp://www.biotech.wisc.edu/Education/
Genetikhttp://vector.cshl.org/dnaftb/
T-Phagenhttp://life.anu.edu.au/viruses/ICTVdB/43010000.htm
Phagen als Vektorenhttp://www.csun.edu/~hcbio027/Bio572_F97/forms/57207.html
Probleme und Risiken mit Gentechnologiehttp://www.netlink.de/gen/Zeitung/980103.htm
http://www.greenpeace.org/~comms/cbio/brief5.html
Molekuarbiologische Methodenhttp://come.to/biomedpage
http://www.msu.edu/user/delgadoi/Protocols.html
DNA-Learning Centerhttp://vector.cshl.org/
Animationen zu Gentechnologiehttp://vector.cshl.org/resources/BiologyAnimationLibrary.htm
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