Herstellung und Chromatographie eines Blattextraktes

Zunächst wollen wir uns einen Blattextrakt herstellen.

scient1

Herstellung eines Blattextraktes

Gras-
oder Brennesselblätter
werden mit der Schere fein zerschnitten und auf nassem Filterpapier
1 Nacht aufbewahrt. Am nächsten Tag werden die Schnipsel in
mehreren Portionen in einen Mörser gegeben. Dazu gibt man genügend
Spiritus und zerreibt das Gemisch mit Sand. Dadurch werden die Zellen
und Chloroplasten aufgebrochen und das Chlorophyll extrahiert. Die
grüne Spirituslösung wird in einen mit Papierfilter belegten
Glaszylinder gegeben mit einer Wasserstrahlpumpe abgesaugt. Diese
Prozedur wiederholt man, bis genügend Rohchlorophylllösung
hergestellt wurde um den Enghalsrundkolben vollständig zu füllen.


Material:

  • 2 Hände voll Gras oder Brennessel
  • Schere
  • Bechergläser
  • Spiritus
  • Sand
  • Mörser
  • Wasserstrahlpumpe
  • Glastrichter + Papierfilter
  • kleiner Enghals- Rundkolben

Auswertung/Beobachtung:

Hält man nun den Kolben mit dem Extrakt vor einen
Tageslichtprojektor, so erscheint die Rundung des Kolbens dunkelrot,
der Hals grün.
die jederman sichtbare Chlorophyllösung erscheint außerhalb
der natürlichen Umgebung plötzlich mal rot, mal grün.

Die Antwort liegt nicht unbedingt auf der Hand. Betrachten
wir noch einmal das Absorptionsspektrum des Chlorophylls.
Blau
und Rot werden
aborbiert, Grün
nur wenig. In der Kolbenrundung ist die Schichtdicke jedoch so groß,
daß dei Grünabsorption sich aufsummiert, d.h. jedes Chl – Moleküle
absorbiert ein wenig Grün.
Da so Blau, Grün und Rot absorbiert werden, erscheint uns die “dicke”
Lösung dunkelrot.

Um zu entscheiden, mit welchen Farbstoffen
man es zu tun hat, trennen wir den Blattextrakt durch Chromatographie
auf.

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Chromatographie eines Blattextraktes

DC-chl1

Dies kann man entweder mit einer Dünnschichtchromatographie
auf Kieselgelplatten oder mit Papierchromatographie erreichen.
Zur Verhinderung der Oxidation wird eine Spur Ascorbinsäure dazugegeben.
Als Laufmittel verwendet man eine Gemisch aus


10 ml Benzin, 5 ml Petrolether und 4 ml Aceton.

Die Lösung wird aufgetüpfelt und abgedunkelt
ca. 50 Minuten laufengelassen.

Ergebnis:

Man erhält fünf bis 6 farbige Banden,
die unter UV-Licht alle
fluoreszieren.

Die Trennung kann auch mit Tafelkreide demonstriert
werden.

Runde Tafelkreide muß 1 Std bei 100°C getrocknet
werden. Dann wird die abgekühlte Kreide senkrecht in ein Becherglas
gestellt, das 5 mm hoch mit der Blattextrakt-Lösung gefüllt
ist. Wenn der Extrakt ca. 1 cm hoch gestiegen ist, wird die Kreide in
ein 100 ml Becherglas gestellt, das mit der obigen Laufmittelmischung
5 mm hoch gefüllt ist. Nach gut sichtbarer Trennung der Banden betrachtet
man die Kreide unter der UV-Lampe.

Kurzer Überblick über
die Chromatographie

Unter dem Begriff Chromatographie
werden eine Reihe mikroanalytischer Trennverfahren zusammengefaßt,
die zur Abtrennung einzelner Verbindungen aus einem vorgegebenen Substanzgemisch
dienen. Erfinder des Verfahrens und des Begriffs ist der russische Botaniker
Tswett (Abb. 25) der 1903 als erster mit
einer Kalksäule Blattpigmente trennte.

Man kennt heute verschiedene Verfahren wie die Dünnschichtchromatographie
(DC)
die Gaschromatographie (GC), die Hochleistungsflüssigkeitschromato-graphie
(HPLC)
oder die sich heute immer mehr durchsetzende Gaschromatographie
gekoppelt mit massenselektivem Detektor (GCMSD).

_lc-sche

Üblicherweise führt man die zu trennenden Teilchen
( mobile Phase) über
ein anderes, unbewegliches Material (stationäre
Phase
). Die Teilchen der beweglichen Phase interagieren auf verschiedene
Weise mit dem Trägermaterial, was zu einer Auftrennung führt.
Dazu können verschiedene Trägermaterialien verwendet werden
wie z. B.

  • Glasplatten beschichtet mit Silikagel bei der Dünnschichtchromatographie
    oder
  • Papier bei der Papierchromatographie,
  • Gase bei der Gaschromatographie und
  • Flüssigkeiten mit hydrophilen und unlöslichen
    Bestandteilen bei der Flüssigkeitschromatographie.

Die Auftrennung erfolgt nach

  • unterschiedlicher Teilchengröße
  • unterschiedlicher Ladung oder
  • unterschiedlicher Affinität zum Trägermaterial.

Dünnschichtchromatographie

Bei der Dünnschichtchromatographie wird das
zu trennende Gemisch als kleiner Fleck auf das Trägermaterial
aufgebracht. Die Komponenten können gegenüber ebenfalls aufgetragenen
Standards identifiziert werden. Eine Seite der Platte wird dann in ein
Laufmittel becken gebracht. Das Laufmittel saugt sich aufgrund
der Kapillarität durch das Trägermaterial und führt das
zu trenende Gemisch mit sich. Dabei haben die zu trennenden Bestandteile
unterschiedliche Wanderungsgeschwindigkeit. Nach einer gewissen
Zeit liegen die Bestandteile in unterschiedlichen Bereichen der Platte
vor (Banden). Sie werden durch UV oder Versatz mit Indikatoren wie Jod
nachgewiesen.

Dc2

Die chromatographischen Daten, die eine Substanz charakterisieren,
sind der Rf-Wert bei der DC
bzw. die Retentionszeit (tr) bei der HPLC oder GC. Die Retentionszeit
(in Minuten) ist die Zeit, die ein Stoff benötigt, um durch eine
Trennsäule hindurchzuwandern. Sie wird zur qualitativen Beschreibung
des Trennvorgangs aus dem Chromatogramm bestimmt. Der Rf-Wert ist
der Quotient aus der Laufstrecke der Substanz zur Laufstrecke des Fließmittels
(Lösungsmittels):

Rf
= Laufstrecke Probe / Laufstrecke Fließmittel

Auswertung und Erklärung der obigen Experimente

Der Blattextrakt im Enghalsrundkolben fluoresziert (leuchtet)
bei intensiver Belichtung dunkelrot.

Was ist Fluoreszenz/Phosphoreszenz?

Fluoreszenz nennt man
das Phänomen, bei dem die Lichtabsorption durch einen bestimmten
Stoff ( Fluorochrom) nach einigen Pico- oder Nanosekunden eine Emission
(Abstrahlung) von Licht
längerer Wellenlänge
zur Folge hat. Man nennt die Gesamtheit der Wellenlängen, die Fluoreszenz
hervorruft Fluoreszenz-Anregungs-Spektrum. Die Gesamtheit der emittierten
(ausgesandten) längerwelligen Wellenlängen nennt man Fluoreszenz-Emissions-Spektrum.
(Das Licht der Leuchtstoffröhren beruht a
uf Fluoreszenz).

Ist die Emission zeitlich verzögert ( ms, Min.),
so spricht man von Phosphoreszenz.
Das Polarlicht (Abb. 27)
und das Bild auf einem Computermonitor ist z. B. auf Phosphoreszenz begründet.

Phosphoreszenz und Fluoreszenz faßt man zur Photolumineszenz
zusammen. Beide hängen vom Energiezustand des Stoffes (Atoms, Moleküls
usw. ) ab. Den quantitaiven Zusammenhang zwischen der Absorption und Konzentration
des absobierenden Stoffes gibt das Lambert-Beersche
Gesetz
.

Die Intensität des emittierten Fluoreszenzlichts
ist eine lineare Funktion der Fluorochromkonzentration. Diese Eigenschaft
von Stoffen wird in der Fluoreszenz-Spektroskopie
ausgenützt, um sie qualitativ oder quantitativ zu untersuchen

in vivo = im lebenden Organismusin vitro = außerhalb des lebenden Systems

Um die in vitro-Fluoreszenz von
Chlorophyll zu erklären, wollen wir zunächst das Bohrsche Atommodell
bemühen, um das Prinzip zu verstehen.

Stoffe bestehen aus Molekülen, Ionen oder Atomen.
Diese wiederum bestehen aus Atomkern und Elektronenhülle. Photoluminiszenz
hat nur mit den Elektronen zu tun. Was geschieht, wenn diese von Licht
getroffen werden, sieht man auf der nachfolgenden Abbildung.

Anreg2

Das vom Photon einer bestimmten Wellenlänge
getroffene Elektron übernimmt die Energie und wird aus seinem Grundzustand
( S0 ) auf eine angeregte
Energiestufe ( S1) gehoben.
Fällt es wieder zurück, sendet es Licht (Strahlung) aus. Jedes
Atom oder Molekül hat mehrere Anregungszustände.

Je höher die
Energie des eingestrahlten Lichts, desto weiter wird das Elektron angehoben
und desto kurzlebiger ist der angeregte Zustand. Besonders leicht beweglich
sind die p
– Elektronen
z. B. der Doppelbindungen. Betrachten Sie sich noch einmal
die Strukturformeln von Chlorophyll und der anderen Pigmente, so finden
Sie immer ein p– Elektronensystem.

Stellvertretend für die anderen Pigmente wollen
wir die Anregungszustände von Chlorophyll
betrachten.

Anger1

Chlorophyll
besitzt mehrere Anregungszustände:

  • S1 = 1. angeregter Singulettzustand
  • S2 = 2. angeregter Singulettzustand
    und
  • T1 = 1. angeregter Triplettzustand

Jeder Energielevel besitzt noch sogenannte Feinenergieabstände.
Um eine Elektron auf den Zustand S1 anzuheben, ist eine bestimmte
Energie
E Abs notwendig. Enthält das anregende Licht etwas
mehr Energie als notwendig, wird das Elektron auf dieser angeregten Stufe
in Schwingungen versetzt, bei noch mehr Energie in Rotationen.

Energie Abs > Energie
Flu ; l Abs
< l Flu (Stokes-Verschiebung)

Aus der Absorptionskurve des Chlorophyll
erkennen wir, daß dieses blaues
und rotes Licht absorbiert. Blaues
Licht
hebt ein getroffenes Elektron auf den S2-Zustand,
rotes Licht in den S1-Zustand.
Der S2-Zustand
ist jedoch zu kurzlebig und das Elektron fällt auf den S1-Zustand
zurück unter Abgabe von Wärme. Vom
S1-Zustand
kehrt das Elektron in den Grundzustand unter Aussendung
von rotem Fluoreszenzlicht zurück. Unter
bestimmten Umständen kann das Elektron aus dem S1-Zustand
unter Wärmeabgabe auf den T1-Zustand
fallen und dann unter Aussendung von längerwelligem Phosphoreszenzlicht
in den Grundzustand zurückfallen.

Die Rotfluoreszenz von Chlorophyll erklärt
sich also dadurch, daß blaues und rotes absorbiertes Licht immer
zur Rotfluoreszenz oder dunkelroter Phosphoreszenz führen.

In vitro findet man für Chlorophyll a eine Fluoreszenzbande
bei ca. 669 nm ( in Ether) und eine Phosphoreszenzbande bei 755 nm. In
vivo wurde schwache Fluoreszenz und keine Phosphoreszenz nachgewiesen.

Im nächsten Kapitel werden wir feststellen, woran
das liegt und was mit der absorbierten Energie in vivo geschieht.

 

 

 

 

 

 

 

 


Abb. 23
Lichabsorption
einer Rohchlorophyllösung
 


KOLBEN1
 

 

 


Abb. 24
DC-Chromatographie
eines Blattextraktes
 


chloroRohchlorophyllösung

leafp2

1. Mischung von Chlorophyll/Carotin in Petroleumbenzin
2-4. Schrittweise Reinigung (Petroleum- benzin)

C. gereinigte Lösung von Carotin in 90% Methanol

 

 

 


Abb. 25
 

Mikhail S. Tswett
Rußland
( 1872 – 1919)

 

tswett

Entdecker der Chromatographie

tafkr

Trennung der Blattfarbstoffe durch Tafelkreide

 

 


Abb. 26
Methoden der Chromatographie
 

M0q7u6sa
Säulenchromatographie

M0q7udss

– Dünnschichtplatten

Trägermaterialen bei Dünnschichtchromatographie

 

 

 

 

 

 

 

 


Abb. 27
Polarlicht
 
Polarli

Fluoreszenzspektroskopie

Fluoresz

Oben Gehirnzellen, die mit einem Farbstoff gefärbt
und mit fluoreszierenden Antikörper besetzt sind. Die Aufnahme
wurde mit einem speziellen Laser-Mikroskop (CLSM) gemacht.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


Abb. 28
Absorption
und Emission bei Atomen

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


Abb. 29
Anregungszustände
des Chlorophyll
 

 

 

Weiterführende
Quellen:
Botanik:http://www.uni-hamburg.de/~biologie/b_online/d00/inhalt.htm
Alles über die Photosynthesehttp://photoscience.la.asu.edu/photosyn/default.html
Lichtreaktionhttp://esg-www.mit.edu:8001/esgbio/ps/light.html
Tutorial Chromatographiehttp://www.gene.com:80/ae/TSN/SS/chromatography_index.html
Chromatographiehttp://www.rocler.qc.ca/pdubreui/chimie_c.htm
http://ull.chemistry.uakron.edu/chemsep/
Simulation Dünnschichtchromatographiehttp://macweb.acs.usm.maine.edu/tanes/tlc.html
Flüssig-Chromatographiehttp://hplc.chem.vt.edu/my_home/book/content/gen_fram.html
Fluoreszenz-Spektroskopiehttp://hendrix.pharm.uky.edu/che626/XRF/history.html

http://phys.educ.ksu.edu/vqm/html/fluorescence.html
Polarlichthttp://rigel.rice.edu/~freeman/dmb/spwea.html
Fluoreszenz und Phosphoreszenzhttp://www.research.microsoft.com/glassner/work/projects/flu/flu.htm
Photosynthese  http://www.emc.maricopa.edu/bio/bio181/BIOBK/BioBookPS.html
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